图1. 工艺表征流程

按图1的流程来体验下Amgen的工程师们是如何思考这些工作模块的。首先是风险分析。由于资源和时间是有限的，可以根据过往历史数据和经验判断，只将在实际细胞培养过程中存在较高风险的环节进行工艺表征研究，选择性忽略“不重要”的环节。那么何为较高风险？这也是需要依据标准风险评估方法，例如Amgen采用的Failure Mode and Effects Analysis（简称：FMEA）方法来进行基于严重性，可能性和可检测性三个维度的打分，并且尽量引入多部门的参与，譬如：临床部门、质量部门、设动部、生产部及研发部（该模式根据每个公司的实际工作情况而定）。并且强烈建议在风险评估时遵从第一性原理。例如：哺乳动物细胞培养需要保证温度稳定，温度过高或过低都会导致细胞停止生长或死亡，对于工艺开发部门可能会将该工艺参数的异常认定是高风险指标，但是从设动部的角度来看温度控制对于反应器而言一般是由TCU控制，TCU通过稳定的电加热和反馈控制回路来保证反应器夹套内的水温稳定在设定值，通过平时对电加热元器件和传感器的定期校准就能最大程度的保证温度控制的精确性。另外就是工厂往往还有备用电源供应来提供停电状态下的电力供给。所以从某种情况下，按照第一性原理的推演方法来判断，在一些场合温度可能就不应该列为高风险工艺参数。综上所述，FMEA方法和第一性原理评估法的引入均是为了帮助实验人员在工艺表征阶段更科学地聚焦核心环节，选择性地忽略“无关紧要”的环节。

第二和三阶段为Scale-Down模型的建立与评估。Amgen的同行在这个环节着重强调了缩小模型选择的要义和评估方法。就抗体的商业化规模而言一般都是2000L以上的规模。选择Scale-Down的规模需要综合考虑反应器的搅拌方式和过往的历史数据。譬如：如果商业化生产为下搅拌方式，那么工艺表征的时候也尽量选择下搅拌来模拟相似的搅拌场；如果过往曾经有过是商业化规模的生产数据，那么就以历史数据作为缩小模型建立的参照；如果只有中试规模的历史数据，可以考虑阶段性的采用中试规模作为缩小模型建立的参照，在商业化规模生产数据有积累后，再进行对Scale-Down模型的重新评估。遵从的第一规则即是Scale-Down模型缩小的倍数越大，实验的投入成本越小，但是必须要保证在具有延续性的工艺参数条件下，商业化规模与Scale-Down模型的关键性能指标相近，并且关键性能指标对单位工艺参数变化的响应幅度也要一致（这一点是Amgen同行强烈建议的金标准）。由于上游细胞培养工艺参数分为体积依赖的工艺参数和非体积依赖的工艺参数，例如接种体积和补料体积等是体积依赖的工艺参数，在建立Scale-Down模型时直接根据缩小倍数换算即可。但是对于通气策略和搅拌速率参数这种属于体积依赖，但又是非线性缩小的工艺参数，就需要根据其它原则来进行换算。例如：对于搅拌速率，Amgen推荐P/V、Impeller Tip Speed和Energy Dissipation规则来进行换算[4-5]，Amgen在本为中选择了P/V和Impeller Tip Speed两个规则进行参数换算，最后确定用P/V规则进行换算的搅拌速度更符合关键工艺性能一致的要求；对于通气策略而言，Scale-Down模型的Spager选择和商业化规模的Spager往往是不一致的。本着以终为始的理念，对于哺乳动物细胞培养而言，我们一般往往会保证Scale-Down模型和商业化培养的DO保持一致，按道理来讲为了保证DO一致，那就保证两个规模下具有相同的VVM即可，但是由于两种规模反应器物理设计的区别，导致Scale-Down模型的VVM一般会略高于商业化规模，这是因为Scale-Down的液面高度较矮，气泡在液体中上升的路径较短，氧气的利用率较低的缘故。另外商业化会采取空气和氧气恒通的方式来降低pCO 2 的效果。一般而言由于Scale-Down模型的VVM略大的缘故，并且配合顶通的设计，造成了pCO 2 在两个规模下很难保持一致，这时候就需要进行评估pCO 2 是否为关键性能指标，如果不是那就对我们建立Scale-Down模型不影响。Amgen在本实验中特意加入了该考察项评估，发现pCO 2 并不会对诸如细胞密度和活力有统计学意义上的影响，故而pCO 2 不作为关键工艺参数。但是也不排除有的项目中，pCO 2 对关键性能指标有实质性的影响，那就需要综合考虑Scale-Down模型的通气策略的设计，来保证模拟出实际大规模生产时的pCO 2 情况 。

一旦Scale-Down模型建立思路和工艺参数设定值确定以后，就需要进行平行实验进行验证，本实验采用了2000L的商业化性反应器和2L的玻璃罐分别进行了4次和6次的平行实验，收集了关键性能指标：Cell Density；Viability，Titer和Normalized Glycosylation Isoform的数据进行统计学对比。Amgen尤其强调了模型可比性的统计方法选择TOST，而非Student t检验的重要性。

第四阶段工作是将上阶段确定出关键工艺参数操作范围。这部分工作的主要目的是为了给商业化生产制定工艺操作范围的边界。采用单因素实验的原因是考虑到不同因子间可能会有非线性的交互作用，故采用每次实验只对一种因子的水平进行调整，保持其它因子水平不变。对于所选因子的表征范围的制定，Amgen也给出了参考意见，见图2。表征空间（Characterization Range）一般会选择3倍于操作空间（Operation Range），而对于操作空间范围的选择需要根据研发部、生产部和设动部对于工艺的理解和基于生产设施的控制精度和可检测技术来确认。以pH的范围选择为例，该案例选择了6个pH水平，并且探讨了不同水平下Viable Cell Density、Viability、Titer和NormalizedGlycosylation Isoform Percentage的影响，见图3。从该实验结果可以清晰地发现，pH范围的变化对于细胞生成和Titer的影响并不具有统计学差异，对正常糖基修饰比例的影响反而随着pH的升高而升高。这些实验数据可以为生产部门制定出合理的pH操作空间给出合理依据。毕竟操作空间制定的过于狭窄会给生产操作带来极大不便，并提高设备的养护成本。当然该案例中还给出了DO不同水平对关键性能指标的影响。感兴趣的读者可以自行下载文献阅读。

图2. Amgen实验中对于单因子操作表征范围选择的示意图

第五阶段工作为研究不同因子之间的交互作用和确定最差实验情况。用文中的原话描述本实验的内容即Interaction and the worst-case study。该阶段的工作就非常贴合实际生产情况，在实际生产中多种因子都可能会同时变化，而且变化方向不定，那么我们在工艺表征中就要尽可能地考虑到此种情况，并厘清在多因子变化情况下，关键性能指标的变化规律和边界。按常规方法如果要做到这点，那将付出无穷无尽地实验投入和时间成本。很庆幸有了实验设计工具帮助，仅仅依靠有限地实验次数，就能得到我们想要的结果。在本实验中Amgen的工作人员采用了JMP公司的统计学软件进行了部分析因实验分析，见图4。4个因子3个水平的部分析因实验仅仅需要18次实验即可找出最差关键性能指标，并分析出因子对关键性能指标的效应值和因子之间的交互情况分析，见图5。

从图4和图5的结果可以看出从单因子的维度来看，DO对Titer和糖基化修饰均有统计学意义上的负效应，而温度对Titer和糖基化是正效应，另外pH只对糖基化修饰有统计学意义的正效应。从实验结果上还可以看到DO和pH对糖基化有正效应影响，而DO和温度对Titer有统计学意义上的负效应，且效应值较大，这就提醒了生产部门在DO和温度在实际情况下都处于变化时需要更加留意关键性能指标的监控。

图3. 不同pH水平下关键性能指标的情况

图4. 部分析因实验设计和结果

图5. 因子的效应值分析和因子间的交互作用分析（针对Titer和糖基化为例）

三、结论

以上内容为Amgen同行给出的关于工艺表征的建议和案例分享，当然由于该文章发表于2006年，时间较为久远，可能目前对于工艺表征的技术和实验工具已有了新的进展，但是思路应该还是没有太大变化，希望该文能够对行业同行有一定的帮助。如有更好的案列推荐还请联系 生物制品圈分享。

作者介绍

求学于分析化学，谋职在生物制品，热诚为行业分享，方向却不取一边，入行已有千日夜，内心仍此间少年，执笔希君多智选，还看设备面面观。

四、参考文件

[1] A Systematic Approach for Scale-Down Model Development andCharacterization of Commercial cell Culture Processes., Feng Li, YasunoriHashimura, Robert Pendleton, Jean Harms, Erin Collins, Brian Lee.,Biotechnology Progress [J]., 2006, 22, 696-703.

[2] A rational stepwise approach to process characterization., Seely, J.E. Seely, R., BioPharm International [J]., 2003, Aug, 24-34.

[3] Optimization, scale-up and validation issues in filtration ofbiopharmaceuticals-Part I., Rathore, A. S., Wang, A., Menon, M., Riske, F.,Campbell, J., Goodrich, E., Martin, J., BioPharm International [J]., 2004, Aug.

[4] Characterization of agitation enviroments in 250 mL spinner vessel,3 L, and 20 L reactor vessels used for animal cell microcarrier culture., Venkat,R. V., Chalmers, J. J., Cytotechnology [J] 1996, 22, 95-102.

[5] Equipment design considerations for large scale cell culture.,Marks, D. M., Cytotechnology [J], 2003, 42, 21-33.

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