北京大学第三医院运动医学科, 北京大学运动医学研究所, 运动医学关节伤病北京市重点实验室, 北京 100191

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关节软骨是人体重要的组织，具有传导载荷、吸收震荡、润滑和抗磨损等特性，其对关节的活动和功能起着重要的作用[1]。但是，由于关节软骨是一种终末分化的结缔纤维组织，缺乏血液供应、淋巴循环以及神经支配，损伤后难以自身修复，为不可逆性和难治性运动伤病[2]。软骨损伤可直接影响患者的运动功能并可导致严重的骨关节炎等关节病变，对普通人的工作和生活造成损害，对运动员运动能力造成严重影响甚至导致其告别职业生涯[3]。

关节软骨主要依靠软骨细胞、细胞外基质(extracellular matrix, ECM)、分泌的生物活性因子以及自身的分子结构等来维持其本身的功能和形态[4]。软骨细胞、ECM、生物活性因子之间的相互作用形成了软骨特异性微环境，如果微环境中物质的分解代谢和合成代谢的动态平衡被打破，将导致不可逆的软骨损伤。目前，国内外已有较多针对关节软骨损伤的治疗方法研究，但仍未达到理想的修复效果，主要原因是未能提供与正常软骨相似或相近的特异性微环境[5]。有效促进软骨修复再生的生物靶点及活性因子构成了软骨修复再生的生物学微环境，损伤区域干细胞募集与转归构成了细胞学微环境，而提供软骨ECM仿生结构构成了其组织结构学微环境。只有从生物因子、分子靶点、细胞及组织结构水平的多维度、多层次构建与软骨组织功能和结构相同或相近的微环境，才可有效促进软骨组织修复再生，弥补现有治疗方案的不足之处。

本文围绕关节软骨组织修复再生这一难题，结合笔者研究团队提出的就解析与构建软骨组织修复微环境的创新理论，对软骨损伤修复再生的生物学微环境、细胞学微环境以及组织结构学微环境的解析与构建进行讨论，并展望关节软骨损伤修复的临床前景与发展方向。

关节软骨是由软骨细胞和ECM组成，共同维持着关节软骨结构及细胞内外的生物学微环境稳态，对软骨的修复再生具有重要影响，其中，生物力学因素是软骨生物学微环境的重要组成之一[6]。本研究团队通过对软骨细胞进行周期性牵张应力刺激，模拟软骨细胞受到的异常应力，发现受到刺激的软骨细胞表面变得粗糙、细胞核减小、染色质出现凝聚，同时COL2A1和Aggrecan的表达水平显著下调，而MMP1和MMP13的表达水平显著上调[7]，这表明异常应力刺激会引发软骨合成和分解代谢出现异常，造成关节软骨细胞生物学微环境稳态失衡，引发软骨退变损伤。在此基础上，我们系统性地筛选了关节软骨退变过程中发挥关键作用的力学相关非编码RNA，并对其靶点及下游信号网络在软骨退变发生发展进程中的作用及机制进行深入研究。我们发现并命名了机械应力相关小分子环状RNA(circular RNA-machine stress related，circRNA-MSR)，研究表明，其可调节肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)的表达，并参与软骨细胞ECM的降解过程，抑制circRNA-MSR可有效促进损伤软骨的修复再生[8]。我们同时发现并命名了与机械应力刺激相关的长链非编码RNA(long noncoding RNA-machine stress related，lncRNA-MSR)，研究显示，其在退变软骨中的表达显著高于正常软骨，且在特定强度的力学刺激下表达量明显上调，并通过与软骨细胞中的microRNA-152竞争来调控TMSB4的表达，从而引发软骨细胞一系列退行性病理改变，而抑制lncRNA-MSR的表达可延缓软骨退变[9]。解析软骨生物力学微环境的变化规律，并靶向调控其中关键的生物靶点，有利于重塑该微环境并促进软骨的修复再生。

除生物力学因素外，软骨ECM代谢相关生物学变化同样在软骨生物学微环境中发挥重要作用。本研究团队利用高通量方法筛选关节软骨ECM代谢过程中发挥关键作用的生物学靶点，进行软骨ECM代谢解析与重塑，发现非编码单链RNA分子microRNA-101通过直接作用于成软骨关键转录因子Sox9参与软骨ECM的降解过程，抑制其表达可通过调控一系列基质降解相关基因的表达延缓软骨ECM的退变进程，改善炎性反应[10]。同时，我们发现并命名了软骨ECM代谢相关小分子环状RNA(circular RNA-cartilage ECM related，circRNA-CER)，其可通过作为miR-136的“吸附海绵”来调控MMP13的表达，从而参与软骨ECM的降解过程[11]。此外，我们还鉴定出软骨ECM损伤相关特异性差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA-cartilage injure related，lncRNA-CIR)，沉默lncRNA-CIR可促进胶原蛋白和聚集聚糖的形成，减少基质降解酶MMP13和ADAMTS5的表达[12]。这些非编码RNA均是未来针对软骨ECM损伤退变临床治疗策略的潜在靶点。

在促进软骨修复再生的小分子药物以及药物递送体系方面的研究发现，高通量方法筛选出的小分子化合物BNTA可以通过上调超氧化物歧化酶(superoxide dismutase 3，SOD3)的活性、催化超氧阴离子的歧化反应来有效促进软骨细胞ECM的合成代谢，从而促进软骨的修复再生[13]。在促进软骨细胞ECM合成代谢的同时，筛选导致其分解代谢的生物学靶点并进行有效特异性抑制，对重塑软骨损伤修复生物学微环境同样至关重要。我们的研究发现，转化生长因子β活化激酶1(transforming growth factor beta activated kinase 1, TAK1)作为固有免疫及适应性免疫反应过程中的关键激酶，在软骨细胞中可引起包括核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)、p38及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)在内的下游免疫相关信号通路活化，引起炎性因子及基质金属蛋白酶表达升高，Ⅱ型胶原表达降低。小分子化合物-真菌来源的天然二羟基苯内酯5Z-7-Oxozeaenol(5Z-7)作为TAK1抑制剂可抑制软骨细胞ECM降解、减轻炎症及改善关节腔内微环境，发挥延缓软骨退变进程的综合性效果[14]。此外，我们发现，受体相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein 1, RIP1)通过骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein 7, BMP7)介导软骨细胞坏死和破坏ECM代谢稳态，在软骨损伤退变中发挥关键作用，使用RIP1的特异性小分子抑制剂necrostatin-1可抑制其导致的软骨细胞坏死和ECM降解，从而促进软骨的修复再生[15]。利用噬菌体展示技术筛选出新型软骨靶向性多肽序列(DWRVIIPPRPSAC，CAP)，可渗透入软骨ECM与软骨细胞特异性结合，减少滑膜组织吸附。利用该多肽片段对聚乙烯亚胺纳米载体进行表面修饰，构建anti-Hif-2α siRNA高效的软骨组织特异性药物输送系统，体内试验证实，CAP-PEI/anti-Hif-2α siRNA可在软骨组织内富集，特异性抑制软骨ECM降解，减轻炎症反应，延缓软骨退变进程[16-17]。

种子细胞是组织工程关节软骨构建和应用中的首要环节和基本要素，种子细胞的选择、利用、募集、动员及示踪构成了软骨修复再生的细胞学微环境。

现有研究中常用的种子细胞有自体软骨细胞与间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，其中自体软骨细胞在关节软骨损伤的治疗中有一定的效果，但存在来源有限、供区并发症及体外细胞培养容易失去软骨细胞表型、需要二次移植手术等问题，限制了其在临床上的使用[18]。MSCs已被广泛应用于组织工程以及再生医学领域，且越来越多的研究更倾向于动员自体内源性MSCs来进行组织的再生和修复，可避免细胞体外培养、保存和回植所带来的各种花费和风险，且能够持续分泌有利于组织修复的生物活性因子，调节局部的免疫反应，从而为损伤区域营造一个有利于组织再生的微环境。与其他组织相比，关节软骨具有独特的解剖结构，即关节软骨与骨髓腔相毗邻，这为动员自体关节软骨缺损处的骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)和原位修复组织缺损提供了有利条件，并可避免体外细胞培养、二次移植手术等问题。然而，利用内源性BMSCs进行原位软骨损伤修复面临着一个亟待解决的问题，即如何高效地将动员出来的自体干细胞准确地募集到组织缺损区域，形成有利于组织再生的干细胞巢和微环境，使其能够在整个软骨修复过程中持续发挥作用。

为了解决组织工程和再生医学中干细胞募集效率低下的问题，本研究团队通过噬菌体展示技术成功筛选出了人源性BMSCs亲和多肽序列(EPLQKM，7个氨基酸短肽，命名为E7)，体内外实验均证实，其对BMSCs具有高度亲和作用，且不存在种属特异性。利用E7共价修饰组织工程软骨支架表面，结合微骨折技术，可特异性募集骨髓腔中内源性BMSCs，增加支架内BMSCs数目，有效改善细胞与支架的结合状态，并在软骨缺损部位发挥干细胞分化修复作用，将人体关节作为一个天然的生物反应器，实现关节软骨组织修复再生[19-20]。E7这个多肽序列结构简单，易于合成和控制，具有高度的稳定性，有临床转化应用前景。在我们的研究之后，东南大学和深圳大学的研究团队也成功将E7偶联到纳米微球或外泌体上，增强了关节腔内BMSCs的募集、迁移和成软骨分化，有效促进了软骨组织修复再生[21-22]。

此外，为进一步研究体内BMSCs在成软骨分化过程中的转归，本研究团队成功研制了稀土元素Yb3+/Ho3+修饰的氟磷灰石上转换荧光粒子(FA: Yb3+/Ho3+)新型晶体标记物，利用FA: Yb3+/Ho3+与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)共同标记BMSCs，体内外实验监测BMSCs在成软骨分化过程中的转归，新型晶体标记物表现出优良的生物相容性和稳定性，在软骨组织工程中具有优异的细胞标记潜力[23]。

组织工程关节软骨构建和应用中的另一个基本要素是组织工程支架，良好的组织工程支架是可以仿生天然组织的ECM功能特性、促进细胞封装并支持细胞增殖和ECM生成的生物材料。软骨组织工程支架的构建、优化和应用构成了软骨修复再生的组织结构学微环境。

目前，利用组织仿生理念制备组织诱导性生物材料支架，激活和诱导人体组织自身修复与再生能力，实现受损组织结构再生和功能重建，是当今生物材料研究中关注的重点。脱细胞基质生物材料是一种具有临床应用前景的生物材料，与人工合成聚合物材料相比，具有更好的生物相容性和生物学特性，可为干细胞提供黏附、增殖及分化微环境，促进损伤组织的修复与再生。我们的研究团队针对关节软骨组织的重要功能与独特性能，开展了有关脱细胞骨基质生物材料修复关节软骨损伤的相关研究[24]。体内外实验结果显示，应用该仿生脱细胞机制材料可有效进行损伤软骨组织部位的修复，新生成的软骨组织特性接近天然透明软骨，且力学性能良好[25-26]，表明脱细胞骨基质生物材料在形态学和生物力学方面都具有人工合成材料无法比拟的优势。

基于前期工作基础，我们的研究团队进一步深入研究了脱细胞骨基质生物材料仿生软骨组织结构及生物活性功能的调控，对脱细胞骨基质材料结构与功能进行改进。我们整合了水凝胶及固态支架的优势，制备出壳聚糖水凝胶-脱细胞骨基质复合支架，并通过对双相支架进行BMSCs亲和多肽E7的修饰，最终构建出结构与功能优化的复合支架(E7-CS-DBM)，结合修复局部髓腔开放释放干细胞技术，使支架具有募集自体、内源性BMSCs的能力，在不涉及外源性细胞的前提下显著增加了软骨修复的细胞量，使其在支架构建的微环境内进行增殖、分化、基质分泌等，最终实现原位软骨组织修复再生[27]。其他脱细胞基质生物支架[如腹膜脱细胞基质(acellular peritoneum-derived matrix, APM) 生物材料]亦具有很好的生物相溶性和细胞附着性，将BMSCs亲和多肽E7与其偶联，建立APM-E7功能支架，体内实验证实了APM-E7功能支架结合微骨折技术可有效募集自体BMSCs，在损伤部位形成新生的透明软骨组织，具有理想的力学稳定性且无移植排斥反应[28]。功能与结构优化的脱细胞基质材料支架结合髓腔开放干细胞释放技术修复软骨损伤与国际同类技术相比，无需自体软骨细胞取材、体外培养及再次手术回植修复，更好地模拟了关节内软骨损伤修复再生的组织结构学微环境，从而为软骨组织工程提供了新的思路。

随着生物3D打印技术的发展与日益成熟，其在软骨组织工程学中也扮演着重要角色，不改变生理成分的前提下提高脱细胞的细胞外基质(decellularized extracellular matrix，dECM)生物墨水的可打印性成为3D细胞打印的一个挑战。我们对肌腱衍生dECM粉末消化过程进行优化，成功制备出生物相溶性好、可打印性强的肌腱dECM生物墨水，可以用于制造复杂的三维有机类结构，显示出其在再生医学和仿生组织工程方面的应用前景[29]。此外，我们以天然生物材料蚕丝蛋白和明胶作为基础材料，采用乙醇和京尼平(genipin)双重交联的新方法，研究出降解和生物力学特性最适合软骨再生修复的蚕丝蛋白/明胶配比，通过增材制造技术对材料进行结构重塑，构建出具有顶盖结构的三维多孔隙个性化支架，并将BMSCs亲和多肽E7偶联于支架，成功构建出结构和功能双重优化的蚕丝蛋白-明胶-干细胞亲和多肽软骨修复功能性生物支架。在动物实验中，将软骨修复支架的应用与髓腔开放干细胞释放技术结合，于体内完成一次性手术原位修复软骨损伤，修复效果满意[30]。

综上所述，软骨修复目前仍然是运动医学及关节外科研究领域的重点与难点，目前修复方法主要存在两方面问题，一方面，缺损区域缺乏有生物活性的成分(细胞、支架)填充，另一方面，这些修复组织缺乏有效的诱导，无法从更为微观的细胞分子水平阐明缺损区的修复再生机制，亦没有提供一个与软骨组织相同或相近的修复微环境，难以有效保证种子细胞的募集、定向分化与软骨组织修复再生。

生物学微环境、细胞学微环境、组织结构学微环境共同组成软骨损伤修复再生的局部微环境与内稳态基础，并在软骨修复中发挥着重要作用。我们基于解析与重塑软骨组织损伤修复再生微环境，从细胞、生物因子、分子靶点及组织结构水平多维度、多层次研究与构建软骨组织修复的局部微环境，提出了结构和功能优化的生物材料支架结合干细胞释放技术进行自体、原位、一次性修复关节软骨损伤的全新再生医学理论，为软骨组织损伤修复的临床转化研究奠定了基础。