1.1 激光扫描共聚焦显微镜成像原理LSCM采用激光束作为光源, 通过共聚焦成像系统, 使得只有聚光镜聚焦到样品中某个焦点上所产生的激发荧光才能成像, 而来自焦点以外的散射光被小孔或狭缝遮挡, 无法在显示器上面显示荧光信号。通过计算机辅助成像系统, 采集和汇聚每一个点上的荧光信号, 形成清晰的二维图像。由于LSCM可以通过程序控制自动调节并改变焦平面,所以可以通过光学切片改变焦平面而获得不同切片的图像, 通过图像叠加, 可以获得样品的三维结 构。

即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式为C16 H15 N5 ·2C3 H6 O3 ，分子量457.48。DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜荧光显微镜")观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) 。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。

DAPI 是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。它结合到双链DNA小沟的AT碱基对处，一个DAPI分子可以占据三个碱基对的位置。结合到双链DNA上DAPI分子的荧光强度提高大约20倍，常用与荧光显微镜观测，根据荧光的强度可以确定DNA的量。另外，因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。单独DAPI的最大吸收波长为340nm，最大发射波长为488nm；当DAPI与双链DNA结合时，最大吸收波长为364nm，最大发射波长为454nm（10 mM Tris pH7.0，100 mM NaCl，10 mM EDTA），其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度只有与DNA结合的荧光强度的1/5，其发散光的波长范围约在500nm左右。

利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

引用：yhttps://www.luyoruv.com/news/news2/dapi.html