已有 12282 次阅读 2019-4-2 10:40 |系统分类:科研笔记

专家解读丨庄小威组在Science总结超分辨显微成像技术[color=rgba(0, 0, 0, 0.298)]原创： [color=rgba(0, 0, 0, 0.298)]苏乾 孙育杰[url=]BioArt[/url] [color=rgba(0, 0, 0, 0.298)]今天

解读丨苏乾、孙育杰（北京大学生命科学学院）

责编丨迦溆

早在1835年，英国科学家乔治・B・爱里（George B. Airy）就提出了“爱里斑”理论：基于光的衍射特性，即使一个无限小的发光点在通过透镜成像系统后，也会形成一个弥散的图案，称为“爱里斑”。爱里光斑在成像平面附近的三维的光强分布被称为光学系统的“点扩散函数”（point spread function，PSF）。随后在1873年，著名的德国科学家恩斯特・阿贝（Ernst Abbe）基于此原理提出了“阿贝光学衍射极限理论”（diffraction limitation），经典的公式也作为其重要成就刻于其墓碑上：

Ernst Abbe的墓碑。图片引自：https://en.wikipedia.org/wiki/Diffraction-limited_system

其中，为光学系统的分辨率（即能分辨的两点之间距离），是探测的发出的光的波长，是成像系统中介质的折射率，是物镜聚焦光锥（light cone）的半角，而又称为一个光学物镜的“数值孔径”（numerical aperture, NA）。根据这一公式，光学显微系统的分辨率极限被限制在约检测光波长的一半，200~300纳米左右（可见光波长范围400-700纳米）――即当两个无限小的点光源相距200纳米以内时，它们的点扩散函数（或是它们的爱里斑）会有很大的重叠造成无法区分的现象，即达到了光学衍射极限。

然而，曾经被认为是不可逾越的理论物理极限，在一个多世纪后的2000~2006年，被相继出现的一系列超高分辨率显微技术“打破”了。诸如“4Pi显微技术”、“基态损耗显微技术”（Ground State Depletion microscopy，GSD）、“受激辐射损耗显微成像技术”（STimulated Emission Depletion, STED）及其衍生“可逆饱和光学荧光转化显微技术”（Reversible Saturable Optical Fluorescence Transitions）、“（饱和）结构光照明显微技术”（(saturated) Structured Illumination Microscopy, (s)SIM/NL-SIM)）及其衍生“非线性SIM”（NL-SIM）、“随机光学重构显微技术”（STochastic Optical Reconstruction Microscopy, STORM）、“（荧光）光敏定位显微技术”（(fluorescent) Photo-Activated Localization Microscopy, (f)PALM）、“点积累在纳米尺度的地形成像技术”（DNA - Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography，(DNA)PAINT）、“超高分辨光学涨落成像技术”（Super-resolution Optical Fluctuation Imaging，SOFI）以及“光漂白和光闪烁的贝叶斯分析技术”（Bayesian analysis of Bleaching and Blinking，3B）等，加之近些年新出现的“最小光子流量成像技术”（nanoscopy with minimal photon fluxes，MINFLUX）、“离散分子成像技术”（Discrete Molecular Imaging，DMI）和“膨胀显微技术”（expansion microscopy, ExM）等，它们通过对标记分子物理原理，化学机制亦或是样品尺寸的研究和改造，成功地“越过”了这一衍射极限。科学家们得以用前所未有的视角观察奇妙的生物微观世界，并带来了瞩目的生物学研究成果。

2018年8月31日，作为STORM超分辨显微技术的发明创始人，哈佛大学庄小威（Xiaowei ZHUANG）教授在Science杂志的特刊Science Special Section“技术改变生物”（图1左）上以通讯作者身份发表了题为Visualizing and discovering cellular structures with super-resolution microscopy的综述文章【1】（图1右），总结了以上提到的超分辨显微成像技术，并详尽地梳理了自问世以来，超分辨显微技术在观察和发现新的细胞结构、功能方面的卓越贡献。

图1 《科学》杂志特刊及庄小威教授发表的综述文章【1】

01

超高分辨显微成像技术有哪些？

通常来说，现有的超高分辨显微技术被分为两大类，以STED和SIM为代表的“基于点扩散函数修饰”和“结构光照明”，还有以STORM/PALM为代表的“基于单分子荧光定位”的超分辨技术（图2）。

第一大类中，STED及其衍生RESOLFT都是利用“甜甜圈”状的空心光束来修饰位于中间激发光的PSF，从而达到直接超分辨成像的目的。不同的是STED利用了荧光染料分子的“受激辐射损耗”性质，RESOLFT利用了荧光蛋白的“光控可逆转化”（photo-reversible）性质。而(s)SIM则是利用了包含样本的结构信息的干涉图案“摩尔条纹”照明方式，加上后期的图像重构，达到超分辨成像的目的，此外，通过引入非线性光学，NL-SIM可以达到更高的分辨率。

第二大类中，STORM和PALM都是利用了荧光染料分子“光控开关”（photo-switchable）或者荧光蛋白的“光控转化”（photo-convertible）性质，达到在一个衍射极限空间内（200~300 nm）随机“点亮”单个荧光分子并进行高精度定位的目的。类似地，PAINT技术利用了对化学反应常数的精确调控，从而达到类似的“点亮”效果（带有荧光标记的分子和靶向分子之间的短暂结合）。

除上述两大类之外，新兴的MINFLUX技术【2】综合了两类成像技术的优点，将定位精度提高到了前所未有的1纳米；膨胀显微技术ExM【3】通过直接将被成像样品进行物理膨胀的手段，间接达到超分辨成像的目的。此外，还有基于荧光信号的涨落，如闪烁（blinking）和漂白（bleaching）的SOFI和3B技术，他们的出现进一步丰富了超高分辨率显微技术的选择和应用。感兴趣的读者可以从下面三篇综述文章中获取更多信息【4-6】。

图2 两大类超高分辨显微技术，基于单分子定位的STORM/PALM，基于点扩散函数修饰的STED/RESOLFT【7】

02超高分辨显微技术有多厉害？

技能一：三维解析能力

2.1

三维解析能力对于超分辨成像技术在生物样品中的应用甚是重要。值得一提的是，“基于单分子定位”的超分辨成像技术借鉴了很多天文学研究的算法，Z轴分辨就是其中一个：通过在成像光路中引入一个柱面透镜达到对点扩散函数的修饰，从而实现三维成像，但Z轴较XY平面分辨率稍差。此外，还有双焦面成像，PSF工程改造和干涉等方法来实现超分辨显微技术的三维解析能力。在STED和RESOLFT中，通过双物镜产生相互抵消的“甜甜圈”照明实现了各向同性的三维超分辨解析能力。

技能二：空间分辨率能力

2.2

超分辨成像技术的重中之重，当然是分辨率的提升。理论上，不论是基于结构光照明的STED，RESOLFT和NL-SIM，还是基于单分子定位的STORM和PALM，都是不受衍射极限约束的，所以他们的理论分辨率是无穷小【1】。但是，在实际的生物样品拍摄中，分辨率受到很多因素的影响，例如激发光的效率，探测器的灵敏度，标记物的光物理性质及其物理大小，标记效率和密度等因素，当然还有生物样品本身的散射和吸收问题。在实际的生物样品拍摄中，这些技术通常能达到10-70纳米的分辨率，少数情况下可以达到小于10纳米的分辨率（比如双物镜STORM，基于DNA-PAINT的DMI和MINFLUX技术等）。

下表简单总结了几种主流超分辨技术的原理、三维成像能力、分辨率和荧光基团要求（总结并不完全，欢迎指正、补充）。

表1 主流超分辨显微成像技术参数总结【1, 4, 6】

对于较厚的生物样品，为了解决散射的问题，近些年发展的适应光学系统（Adaptive Optics, AO），光片照明技术（Light-Sheet Illumination），组织透明化处理（Tissue Clearing）和物理切片等技术方法也取得了可喜的成果。

技能三：活细胞成像，时间分辨率和光毒性

2.3

对于STED，RESOLFT和SIM来说，活细胞成像、时间分辨率都是其技术优势，STED和RESOLFT在较小的视场下可以达到很高的时间分辨率（ 收藏 IP: 202.100.211.*| 热度|