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更新时间：2021-09-12 09:21:53

《生物化学实验课》课程教学大纲

课程代码：

课程负责人：张蕾

课程中文名称:生物化学实验课

课程英文名称：Experiment of Biochemistry

课程类别：必修/选修/公共选修/通识教育选修（选其一）

课程学分数：2学分

课程学时数：72学时

授课对象：本科生

本课程的前导课程：《生物化学》理论课

一、 教学目的

生物化学实验”是生物学科本科生的一门专业基础课。要求学生掌握生物化学基本的实验方法和操作技能，同时加深对生物化学理论的认识和理解，培养学生发现问题、分析问题和解决问题的能力以及创新能力，培养学生严谨的事实求是的科学作风和合作精神，激发学生自己动手做实验的浓厚兴趣。

二、 教学要求

本课程利用多媒体教学手段讲解实验的基本原理、方法以及相关仪器的使用方法。通过本课程的学习，使学生基本掌握蛋白质的分离纯化及鉴定，酶活性测定、动力学分析和在代谢研究中的应用，核酸提取及相关研究的方法和技术；要求学生通过自选实验掌握糖、脂类和维生素测定和分析的方法；通过综合性实验的练习，培养学生分析问题、发现问题和解决问题的能力。

在实验课的讲解中，教师要注重理论联系实际，讲解到位，要求明确，适时、实地考查学生动手操作情况，及时纠正学生操作上存在的问题。

学生必需严格遵守实验室规则，认真对待每一次实验，真是记录实验结果并完成实验报告。鼓励学有余力的学生自行设计实验并参与实验课的改革、积极与老师交流实验新的和体会，以促进生物化学实验课的教学改革，使实验课的安排和内容设置更加合理，实验内容更加丰富和有吸引力，从而使“生物化学实验” 课真正成为有益于学生学知识、学本领的专业基础课。

三、 课程内容与学时分配

第一部分 糖化学 共计8学时

1、糖的呈色反应和定性鉴定 4学时

2、总糖和还原糖的测定——3,5－二硝基水杨酸法  4学时

第二部分 蛋白质化学  共计24学时

3、蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐  5学时

4、蛋白质的定量测定：考马斯亮蓝方法和Fullin-酚法   5学时

5、结构分析初步-蛋白质末端的测定——I  4学时

6、结构分析初步-蛋白质末端的测定——II  4学时

7、蛋白质电泳分析不同动物组织中的全蛋白  6学时

第三部分 酶化学  共计26学时

8、蔗糖酶的制备及各步比活力的测定   6学时

9、底物浓度对酶反应速度的影响及Km值的测定   5学时

10、正交法测定蔗糖酶的最适反应条件（pH、温度、抑制剂对酶活力的影响）   5学时

11、乳酸脱氢酶活力测定——比色法    4学时

12、氨基转换反应的定性鉴定（层析法）   6学时

第四部分 核酸化学  共计14学时

13、动物基因组DNA的制备  5学时

14、DNA定量和纯度测定  5学时

15、酵母RNA的提取及组份鉴定  4学时

实验一 糖的呈色反应和定性鉴定

【目的要求】 1、学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。

    2、了解鉴定还原糖的方法及其原理。

Ⅰ. Molish反应——α-萘酚反应

【实验原理】

糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与α-萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。

【实验试剂】 Molish试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

Ⅱ. 蒽酮反应

【实验原理】

糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。

【实验试剂】 蒽酮试剂：取0.2g 蒽酮溶于100mL 浓硫酸中，当日配制。 待测糖溶液，同Molish试验。

Ⅲ. 酮糖的Seliwanoff反应

【实验原理】

该反应是鉴定酮糖的特殊反应。酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需20-30秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。

【实验试剂】 Sediwanoff试剂：0.5g 间苯二酚溶于1升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前配制。 1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。

Ⅳ. Fehling试验

【实验原理】

费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。硫酸铜与碱溶液混合加热，则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。 为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin试剂中加入酒石酸钾钠，它与Cu2＋形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不于酮和芳香醛发生反应。

【实验试剂】 试剂甲：称取34.5g硫酸铜溶于500mL蒸馏水中。 试剂乙：称取125g NaOH 137g酒石酸钾钠溶于500mL蒸馏水中，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

Ⅴ. Benedict试验

【实验原理】

Benedict试剂是Fehling试剂的改良。Benedict试剂利用柠檬酸作为Cu2+的络合剂，其碱性较Fehling试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。

【实验试剂】 Benedict试剂：将170g 柠檬酸钠和100g 无水碳酸钠溶于800mL水中；另将17g硫酸铜溶于100mL热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000mL。 该试剂可长期使用。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

Ⅵ. Barfoed试验

【实验原理】

在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Barfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜，时间约为3分钟，而还原二糖则需20分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。

【实验试剂】 Barfoed试剂：16.7g 乙酸铜溶于近200mL水中，加1.5mL冰醋酸，定容至250mL即可。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。

实验二 总糖和还原糖的测定

──3,5－二硝基水杨酸法

【目的要求】

掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。

【实验原理】

在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

【实验内容】

1、 还原糖的测定；

2、 总糖含量的测定

【试剂和器材】

1、试剂

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂：称取6.5g DNS溶于少量热蒸馏水中，溶解后移入1000mL容量瓶中，加入2mol/L氢氧化钠溶液325mL，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。

葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至100mL，即含葡萄糖为2.0mg/mL。

6mol/L HCl：取250mL浓HCl（35%～38%）用蒸馏水稀释到500mL。

碘－碘化钾溶液：称取5g碘，10g碘化钾溶于100mL蒸馏水中。

6mol/L NaOH：称取120g NaOH溶于500mL蒸馏水中。

0.1% 酚酞指示剂。

2、材料

藕粉，淀粉。

3、器材

试管1.5×15cm（×13）, 3.0×20cm（×1）；移液管0.2mL（×2），0.5mL（×2），1mL（×5）， 10mL（×1）；水浴锅；电炉；分光光度计。

实验三  蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐

【目的要求】

1、了解盐析分级分离蛋白质的基本原理及操作；

2、了解葡聚糖凝胶SephadexG-25脱盐的基本原理和凝胶柱的制备及洗脱技术；

3、掌握752型紫外分光光度计的使用方法。

【实验原理】

用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

【实验内容】

1、蛋白质的盐析分级分离；

2、SephadexG-25脱盐；

3、盐离子的跟踪检测；

4、ＵＶ检测蛋白质。

【实验材料和用品】

1、新鲜蛋清或血清；2、饱和硫酸铵溶液；3、试管；4、葡聚糖凝胶G-25；5、752型紫外分光光度计，石英比色皿；7、玻璃层析柱，乳胶管和止水夹。

实验四 蛋白质的定量测定：考马斯亮蓝方法和Fullin-酚法

【目的要求】

1、学习Folin—酚法测定蛋白质含量的原理和方法；

2、学习考马斯亮兰法测定蛋白质含量的原理和方法。

【实验原理】

Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2, -CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg蛋白质。

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。

【实验内容】

1、Folin—酚法测定小白菜中的蛋白质含量；

2、考马斯亮兰法测定小白菜中的蛋白质含量。

【实验材料和用品【

Folin—酚法所需要的材料和药品：

1、试剂

Folin—酚试剂:

试剂甲：

1) 4%碳酸钠溶液

2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液

3) 1%硫酸铜溶液

4) 2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。

试剂乙：

称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。

试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。

2、标准和待测蛋白质溶液

标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150μg/mL蛋白溶液

待测蛋白质溶液：小白菜匀浆液

3、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温水

浴；分光光度计。

考马斯亮兰法所需的材料和药品：

     1、试剂

考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。

2、标准和待测蛋白质溶液

标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

待测蛋白质溶液：小白菜匀浆液

3、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温

水浴；分光光度计。

实验五、六  结构分析初步-蛋白质末端的测定

【目的要求】

1、掌握聚酰胺薄膜层析技术的基本方法和应用；

2、熟悉蛋白质及肽的N末端氨基酸DNS分析法。

【实验原理】

荧光试剂二甲氨基萘磺酰氯(dansyl—Cl，简称DNS-C1)在碱性条件下与氨基酸(肽或蛋白质)的氨基结合成带有荧光的DNS—氨基酸(DNS—肽或DNS—蛋白质)，DNS—蛋白质再经酸水解可释放出DNS—氨基酸，DNS-C1能与所有的氨基酸生成具荧光的衍生物，其中赖氨酸、组氨酸、酪氨酸、天冬酰胺等氨基酸可生成双DNS—氨基酸衍生物。这些衍生物相当稳定，可用于蛋白质的氨基酸组成的微量分析，灵敏度可达10－10～10－9mol水平，比茚三酮法高10倍以上，比过去常用的FDNB法高100倍。将Edman法和DNS法结合起来(称为Edman—DNS法)应用于蛋白质结构的序列分析上作，可以提高Edman法的灵敏度及其分析速度。DNS—氨基酸衍生物在6mol/L盐酸中105℃水解22小时，除DNS—色氨酸全部被破坏，DNS-脯氨酸(77％)，丝氨酸(35％)，甘氨酸(18％)，丙氨酸(7％)部分被破坏外，其余DNS—氨基酸很少破坏。故DNS法可用于蛋白质和肽的氨基酸组成N末端分析。DNS—C1与蛋白质的侧链基团巯基、咪唑基、ε-氨基和酚羟基反应，前两者在酸碱条件下均不稳定，酸水解时完全破坏；DNS-ε-赖氨酸和DNS-O-酪氨酸较稳定，同时还有DNS-双-赖氨酸和DNS-双-酪氨酸生成，层层后在层析图谱的位点上，都与DNS-α-氨基酸有区别。DNS-C1在pH过高时，水解产生副产物DNS-OH，  在DNS-C1过量时，会产生DNS—NH2，DNS-氨基酸在紫外光照射下呈现黄色荧光，而DNS-OH和DNS-NH2产生蓝色荧光，可彼此区分开。DNS-氨基酸在酸性条件下(pH2～3)一般都可被乙酸乙酯抽提，然后取乙酸乙酯层点样 层析，这样大量DNS-C1的反应副产物DNS-OH可留于水相，干扰因素减少，所得层析图谱清晰。但若是DNS-精氨酸，DNS-天冬氨酸，DNS-谷氨酸，DNS-苏氨酸，DNS-丝氨酸则它们大部分或部分留于水相，往往会被遗漏，而导致错误结论。这时可将样品浓缩干，用甲醇直接溶解后点样，由于上述DNS-氨基酸的层析位置都位于DNS-OH的右侧，影响不大，这一点在测定多肽或蛋白质的N末端时要特别注意。

DNS-氨基酸可用聚酰胺薄膜层析法进行分离和鉴定，在薄膜上检测灵敏度为0．01μg(相当于10—10mol)。聚酰胺薄膜层析是1966年后发展起来的一种新层析技术。由于它具有灵敏度高，分辨力强，快速，操作方便等优点，已被广泛应用于各种化合物的分析。在用于分析测定氨基酸衍生物方面超过了过去使用的纸层析、纸电泳、硅胶薄板层析等方法。聚酰胺是—类化学纤维原料，即锦纶(又称尼龙)。由己二酸与己二胺聚合而成的称锦纶66 。因为在这类物质分子中都含有大量酰胺基团，故统称聚酰胺。它对很多极性物质有吸附作用，这是由于聚酰胺的一C＝O及>NH基能与被分离物质之间形成氢键。如酚类(包括黄酮类、鞣质等)和酸类

【实验内容】

1、蛋白质N末端的标记；

2、蛋白质酸水解；

3、聚酰胺薄膜层析。

【实验材料和用品】

0.1mLDNS-C1丙酮溶液；氢氧化钠；乙酸乙酯；碳酸氢钠；丙酮；烘箱；标准氨基酸和待测蛋白质；层析缸；聚酰胺薄膜；毛细管；甲酸(88％)：水＝1. 5：100(V／V)；波长360 nm或280 nm的紫外灯；水解管(硬质玻璃)。

实验七  蛋白质电泳分析不同动物组织中的全蛋白

【目的要求】

1、掌握聚丙烯酰胺凝胶的制备原理和方法；

2、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和操作方法；

【实验原理】

本实验用聚丙烯酰胺凝胶为支持物，分离心肌、肝组织、肾组织提取液，其优点是设备简单、操作方便、标本用量少、电泳时间短及区带分离清晰等。

【实验内容】

1、非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备；

2、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；

3、全蛋白质的染色；

 [实验材料和用品]

电极缓冲液；TEMED；30%凝胶原液；pH 8.9 Tris缓冲液；pH 6.8 Tris缓冲液；10%过硫酸铵；考马斯亮兰G250染液；电泳仪；匀浆器等。

实验八  蔗糖酶的制备及各步比活力的测定

【目的要求】

1、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶的原理和方法；

2、掌握蔗糖酶活性测定的一般方法。

【实验原理】

酵母中的蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的,称之为外蔗糖酶，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27kDa(或22 kDa，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5kDa。两种酶底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验采用研磨水抽提，提取纯化的主要是外酶。

蔗糖酶特异性催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解,具有相对专一性,能催化蔗糖水解生成D-果糖和D-葡萄糖,也能水解棉子糖生成密二糖和果糖。3,4-二硝基水杨酸与还原糖在强碱性溶液中沸水浴生成棕红色氨基化合物.在520nm处有最大吸收,在一定范围内颜色深浅与还原糖浓度成正比酶活性单位为,在一定条件下反应5min,每产生1mg葡萄糖所需要的酶量。实际应用是1 ml酶液所产生葡萄糖的量定为1ml酶液的活力。 酶的比活力，每 mg酶蛋白质所具有的酶活力。

【实验内容】

1、提取啤酒酵母中的蔗糖酶；

2、蔗糖酶制备过程中各部分比活力的测定；

3、葡萄糖标准浓度曲线的制备；

4、蔗糖酶中蛋白质含量的测定。

 【实验材料和用品】

啤酒酵母；二氧化硅；预冷的去离子水1mol/L乙酸；95%乙醇；葡萄糖；二硝基水杨酸溶液；蔗糖。研钵；离心管；滴管；试管；量筒；恒温水浴锅；广泛pH试纸；高速冷冻离心机；722型分光光度计。

实验九  底物浓度对酶反应速度的影响及Km值的测定

【目的要求】

1、掌握双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值的原理和操作方法；

2、能够根据实验要求设计具体的实验操作方案。

【实验原理】

酶的动力学性质分析，是酶学研究的重要方面。测定Km 和Vmax，特别是测定Km，是酶学研究的基本内容之一，Km是酶的一个基本的特性常数，它包含着酶与底物结合和解离的性质，特别是同一种酶能够作用于几种不同的底物时，米氏常数Km往往可以反映出酶与各种底物的亲和力强弱，Km值越大，说明酶与底物的亲和力越弱，反之，Km值越小，酶与底物的亲和力越强。本实验根据双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值。

【实验内容】

1、蔗糖酶的稀释，并根据酶活力的预示结果进一步的稀释蔗糖酶；

2、不同底物浓度条件下的蔗糖酶活力测定；

3、Km值的计算。

【实验材料和用品】

乙酸；葡萄糖；果糖；蔗糖；二硝基水杨酸溶液。

722型分光光度计；水浴锅；试管及试管盖。

实验十  正交法测定蔗糖酶的最适反应条件

【目的要求】

1、掌握正交法的原理和应用；

2、学习自己设计实验；

3、测定蔗糖酶的最适反应条件。

【实验原理】

酶反应受到多种因素的影响，如底物浓度、酶浓度、温度 pH 值、激活剂和抑制剂等都能影响酶反应速度。这种多因素的试验可通过正交法即用一特制的表格 —— 正交表来安排试验，计算和分析试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。实践证明正交法是一个多、快、好、省的方法，目前已广泛用于工、农、医药业生产和科学实验中。 本实验运用正交法测定底物浓度、酶浓度、温度 pH 值达四个因素对酶活性的影响，并求得在什么样的底物浓度、酶浓度、温度和 PH 值时酶的活性最大。通过本实验初步掌握正交法的使用。

【实验内容】

1、设计正交表；

2、配置自己所需的实验试剂；

3、根据正交表设计实验方案；

4、蔗糖酶反应；

5、实验结果的分析，找出最适合的反应条件。

【实验材料和用品】

磷酸氢二钠；磷酸二氢钠；柠檬酸；乙酸钠；乙酸；脲；二硝基水杨酸；蔗糖。

试管；722型分光光度计；

实验十一  乳酸脱氢酶活力测定

【目的要求】

1、了解乳酸脱氢酶活性测定原理。

2、学习用比色法测定酶活性的方法。

【实验原理】

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH，EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。

LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等。

本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及NADH的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下每分钟A340下降值为1.0的酶量为1个单位。

【实验内容】

1、乳酸脱氢酶活性测定

【试剂和器材】

1、试剂

50mmol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液母液：

A: 50 mmol/L K2HPO4: 称K2HPO41.74g加蒸馏水溶解后定容至200mL。

B: 50 mmol/L KH2PO4: 称KH2PO43.40g加蒸馏水溶解后定容至500mL。

取溶液A 31.5mL ＋溶液B 68.5mL, 调节pH至6.5。置4℃冰箱备用。

10mmol/L pH 6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液用上述母液稀释得到。现用现配。

0.2 mol/L pH7.5磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液母液：

A: 0.2 mol/L Na2HPO4: 称Na 2HPO4·12H2O 71.64g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。

B: 0.2 mol/L NaH2PO4: 称NaH2PO4·2H2O 31.21g加蒸馏水溶解后定容至1000mL。

取溶液A 84 mL ＋溶液B 16 mL, 调节pH至7.5。置4℃冰箱备用。

0.1mol/L pH 7.5磷酸盐缓冲液, 用上述母液稀释得到。现用现配。

NADH溶液：称3.5mg纯NADH置试管中，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液1mL摇匀。现用现配。

丙酮酸溶液：称2.5mg丙酮酸钠，加0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液29mL, 使其完全溶解。现用现配。

2、材料

兔肉。

3、器材

组织捣碎机；移液管5mL（×2）, 0.1mL（×2）)；微量注射器10μl（×1）；恒温水浴；

分光光度计。

实验十二  氨基转换反应的定性鉴定

【目的要求】

1、了解转氨酶在代谢过程中的重要作用。

2、学习应用纸层析法鉴定氨基转换反应。

【实验原理】

体内α-氨基酸的α-氨基在氨基转换酶的作用下，移换至α-酮酸的过程，称氨基转换作用。此类酶各有一定的特异性，普遍存在于动物各组织中。

本实验是将谷氨酸与丙酮酸在肌肉糜中谷氨酸－丙酮酸氨基转换酶（简称谷－丙转氨酶）的作用下进行氨基转化反应，然后用纸层析法检查反应体系中丙氨酸的生成。由于谷氨酸、丙酮酸在肌肉糜中可循其他代谢途径分解和转化，影响氨基转换过程的观察，因此在反应体系中添加碘醋酸（或溴醋酸）以抑制谷氨酸和丙酮酸的其他代谢过程。

【实验内容】

1、转氨酶作用

2、层析验证

【实验材料和用品】

1、试剂

1%谷氨酸溶液（用1% KOH溶液调到中性）；1%丙酮酸钠溶液（用1% KOH溶液调到中性）；0.1%KHCO3溶液；0.025％溴醋酸溶液（用1% KOH溶液调到中性）；2% Hac溶液；0.1%标准谷氨酸溶液；0.1%标准丙氨酸溶液；1%KOH溶液。

展开剂：酚饱和水溶液：2份酚加1份水混合放入分液漏斗，振荡。静置24小时后分层，取下层酚置瓶中备用；

显色剂：0.1%茚三酮正丁醇溶液。

2、材料

肌肉糜：取兔子肌肉2g，置研钵中，加0.9% 氯化钠溶液6mL，在低温下研磨成细浆，离心5分钟（3000转/分），弃去沉淀，得肌肉糜提取液。

3、器材

试管1.5×15cm（′ 4）；研钵（或玻璃匀浆器）；毛细管；烧杯；恒温水浴；培养皿9cm（′ 2）；直径13cm圆形滤纸；喷雾器；吹风机。

实验十三 动物基因组DNA的制备

【目的要求】

1、掌握盐溶法大量制备动物基因组DNA的基本原理和方法。

【实验原理】

本实验通过加入低盐溶液匀浆、离心得到细胞核组分，然后用SDS（十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate）裂解核膜，释放出DNA-蛋白质复合物，加入高浓度NaCl，以增加DNP的溶解度，加入氯仿—异戊醇混合液，振荡、乳化，使蛋白质变性，DNP复合物解离，离心后，DNA溶于上层水相，蛋白质沉淀夹在水相和有机相之间得以除去，最后用有机溶剂沉淀出DNA。

【实验内容】

1、制备动物基因组DNA

【实验材料和用品】

1、试剂

   SC缓冲液；5%SDS溶液；95%乙醇、氯仿和异戊醇。

2、冷冻离心机；组织捣碎仪；烧杯；量筒；玻璃棒；三角烧瓶和离心管。

实验十四  DNA定量和纯度测定

【目的要求】

1、掌握紫外分光光度计测定DNA浓度的原理和方法；

2、掌握二苯胺方法测定DNA浓度的原理和方法。

【实验原理】

紫外分光光度法（此法要求核酸纯度很高，1个Abs相当于50ug/ml双螺旋DNA,除了定量测定以外还可进行核酸纯度的检测，A260/A280比值，纯的DNA为1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。）

DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40~400μg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。

【实验内容】

1、紫外紫外分光光度法测定制备DNA的浓度，并计算DNA的得率；

2、二苯胺方法测定制备DNA的浓度，并同紫外紫外分光光度法测定制备DNA的浓度进行比较，分析二者的优缺点。

【实验材料和用品】

紫外分光光度计；二苯胺试剂；722型分光光度计。

实验十五  酵母RNA的提取及组份鉴定

【目的要求】

1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。

2、了解核酸的组分并掌握其鉴定方法。

【实验原理】

由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

RNA含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮可使RNA水解，从水解液中可用定糖，定磷和加银沉淀等方法测出上述组份的存在。

【实验内容】

1、 酵母RNA提取

2、 RNA组份鉴定

【实验材料和用品】

0.04M NaOH溶液；95%乙醇；1.5M硫酸；浓氨水；0.1M硝酸银；酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mL HCl；三氯化铁浓盐溶液：将2mL 10％三氯化铁（FeCl3· 6H2O）溶液加入400mL浓HCl；苔黑酚(3,5-二羟基甲苯)乙醇溶液：称取6g苔黑酚溶于95％乙醇100mL；定磷试剂：17％硫酸：将17mL浓硫酸（比重1084）缓缓倾入83mL水中；2.5％鉬酸铵：2.5g鉬酸铵溶于100mL水中；10％抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100mL 水，棕色并保存溶液；临用时将三种溶液和水按下列比例混合：17％硫酸：2.5％鉬酸铵：10％抗坏血酸：水＝1：1：1：2（V/V）。

干酵母粉。

移液管0.2mL（×1）,2.0mL（×1）, 1mL（×4）; 量筒10 mL（×1）, 50mL（×1）; 滴管；水浴锅；离心机。

四、教材与参考书

实验课教材：

邵雪玲 毛欣 《生物化学与分子生物学实验指导》，武汉大学出版社

实验参考书：

1．  陈毓荃 《生物化学实验方法和技术》，科学出版社

2．  杨建雄 《生物化学与分子生物学实验技术教程》，科学出版社

3．  赵永芳 《生物化学技术原理及应用》（第三版），科学出版社

4．  陈钧辉，陶力，李俊，朱婉华，袁玉荪 《生物化学实验》（第三版），科学出版社

5．  雷东锋 《现代生物化学与分子生物学仪器与设备》，科学出版社

五、考核方式

实验课成绩：

l  实验预习情况（10%）

l  实验操作情况（30%）

l  实验报告情况（30%）

l  实验考试成绩（20%）

l  实验素质（10%）