张 峰，王正荣，蒋建军，薄新文，张艳艳，贾春英

(1.石河子大学动物科技学院，新疆石河子 832000 ；2.新疆农垦科学院畜牧兽医研究所/省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆石河子 832000；3.新疆生产建设兵团第三师畜牧兽医工作站，新疆图木舒克 843901)

梨形虫病(Piroplasmosis)是一类经硬蜱传播，由巴贝斯属(Babesia)和泰勒属(Theileria)原虫所引起的血液原虫病的总称[1]，主要引起宿主贫血消瘦、黄疸高热、血红蛋白尿等临床症状，严重时可导致宿主的死亡[2]。梨形虫种类繁多，迄今为止，全球范围内所记载的各种哺乳动物的巴贝斯虫有67种[3]，泰勒虫有13种[4]。根据联合国粮农组织(FAO)统计，蜱及蜱传原虫病每年对畜牧业造成约70亿美元的经济损失。及早地发现、确诊是有效防控该病的关键，目前最为简单的临床诊断方法为血涂片(或淋巴结穿刺)镜检，但无法准确鉴定不同虫种，且灵敏度较低。血清学诊断方法虽然灵敏度、特异性较高，但不一定能证明寄生虫感染的存在，也不一定能证明保护性免疫的存在，因为常出现不同虫种的交叉反应，造成大量的假阳性[5-6]。近些年来，PCR技术已经逐渐成熟，用以检测血液中梨形虫DNA的分子方法具有较高的灵敏度和特异性，已被证明是进行流行病学调查的有力工具。本研究旨在调查小海子垦区牛梨形虫具体病原种类，以采集牛血液样本作为研究对象，应用PCR技术揭示该区域梨形虫种群分布，形成该区潜在或外来入侵病原对人畜健康、公共卫生安全的风险评估及预警报告。

1.1.1 样品 2020年5月至2020年11月在新疆小海子垦区7个采样点(红旗农场、东风农场、叶城牧场、伽师总场、44团、45团、51团)共采集牛抗凝血568份，使用一次性静脉采血针和EDTA抗凝管采集动物颈静脉血，带回实验室放置-20 ℃冰箱进行冷冻保存，并进行相关检测。

1.1.2 主要仪器与试剂 梯度PCR仪，赛默飞公司产品；凝胶成像仪，美国Bio-Rad公司产品；血液/细胞/组织基因组DAN提取试剂盒，天根(TIANGEN)生化科技有限公司产品；DNA标准DL 2 000，TaKaRa公司产品。

1.2.1 基因组DNA的提取 取200 μL抗凝血置于1.5 mL PE管中，并按照血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒说明书来提取DNA。

1.2.2 牛梨形虫18S rRNA基因扩增 引物参考已发表的巴贝斯虫和泰勒虫18S rRNA特异性引物[7-8](表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系(20 μL)：Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，模板DNA 1 μL，上、下游引物各0.5 μL。巴贝斯虫反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 1 min，62 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 5 min。泰勒虫反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s，共30个循环；72 ℃ 10 min。最后取10 μL PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 引物序列及目的片段长度

1.2.3 序列测定与分析 将PCR阳性扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序。登录美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站，通过Blast进行基因的同源序列对比。应用Clustal W软件进行多序列比对，最后利用MEGA7软件，使用邻接法(Neighbor-joinning)构建系统发育树，其自展值检验(Bootstrap test)为1 000。

使用巴贝斯虫和泰勒虫特异性引物对于小海子垦区568份牛血样品进行PCR检测，经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，共检测出44份阳性样品，总阳性率在7.75%。其中45团的牛感染率较高，约14.58%；叶城牧场与53团的牛感染率较低，均在5%以下；46团的牛未发现梨形虫。不同地区牛梨形虫检测率见表2。

表2 小海子垦区各地区牛泰勒虫PCR检测结果

在568份牛血样中，共检测出44份阳性样品。将44份阳性样品全部送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序，测序结果在NCBI上进行Blast搜索，结果显示,其中42份为环形泰勒虫(T.annulata)，其余2份为东方泰勒虫(T.orientalis)。经15 g/L凝胶电泳检测，结果显示,泰勒虫阳性条带约1 530 bp。凝胶电泳结果见图1。

随机挑选测序成功的样本，与GenBank中已经注册的牛梨形虫18S rRNA序列进行比较，检出的2种泰勒虫与GenBank上已发表的泰勒虫虫种序列的同源性均大于97%。以牛巴贝斯虫未定种新疆株(Babesiasp.Xinjiang，XM029015910)作为外类群，使用MEGA 7软件，以邻接法构建系统发育进化树。结果发现，测定的环形泰勒虫(T.annulata)与环形泰勒虫意大利株(GenBank登录号：MT341858)、环形泰勒虫喀什株(GenBank登录号：MK415058)的同源性均为100%。测定的东方泰勒虫(T.orientalis)与东方泰勒虫东北株(GenBank登录号：HM538201)、东方泰勒虫巴基斯坦株(GenBank登录号：MG599096)的同源性均为99%。2种泰勒虫系统发育进化树见图2和图3。

M.DNA 标准DL 2 000;1～5.阳性样本; 6.阳性对照; 7.阴性对照

图2 基于环形泰勒虫18S rRNA基因构建的系统发育树

图3 基于东方泰勒虫18S rRNA基因构建的系统发育树

小海子垦区位于新疆叶尔羌河流域下游，地处塔克拉玛干沙漠西北边缘，属于暖温带大陆性干旱气候。小海子垦区作为新疆生产建设兵团第3师三大垦区之一，养殖业为其主要基础产业，也是重要的经济来源，主要饲养牛、羊等家畜。因其独特的地理气候以及丰富的宿主资源，为牛梨形虫的生存提供了适宜的环境。

通过对于牛血样进行PCR检测，发现了环形泰勒虫(T.annulata)、东方泰勒虫(T.orientalis)，且环形泰勒虫(T.annulata)为优势种，但并未发现巴贝斯虫。本文所发现的环形泰勒虫(T.annulata)与环形泰勒虫意大利株(GenBank登录号：MT341858)的同源性为100%，这与王冰洁[9]在吐鲁番地区所发现的结果相同。此外，本文所发现的环形泰勒虫(T.annulata)与环形泰勒虫喀什株(GenBank登录号：MK415058)的同源性也为100%，造成这种结果的原因可能是由于小海子垦区与喀什相邻，两地牲畜频繁交易。简子健等[10]在2006年-2008年曾对全疆14个地、州、市进行了流行病学调查，结果发现了环形泰勒虫(T.annulata)是新疆牛梨形虫病的主要病原，感染率居高不下(>11%)，遍及各个州市，也确定了环形泰勒虫(T.annulata)在新疆地区为优势种。自1930年在俄罗斯发现东方泰勒虫(T.orientalis)以来，澳大利亚、日本、韩国、越南、印度等地都有相关的报道。在我国，东方泰勒虫主要存在于吉林、辽宁、甘肃、河南、河北、湖南、贵州等地。本文所发现的东方泰勒虫(T.orientalis)与东方泰勒虫东北株(GenBank登录号：HM538201)、东方泰勒虫巴基斯坦株(GenBank登录号：MG599096)的同源性均为99%，证明了新疆地区也存在东方泰勒虫(T.orientalis)。但目前新疆地区有关东方泰勒虫(T.orientalis)的报道较少，对于新疆地区东方泰勒虫(T.orientalis)的研究有待深入。

综上所述，本文对新疆小海子垦区牛梨形虫的感染情况和感染虫种进行了调查，提供了分子依据，为摸清小海子垦区牛梨形虫病基线提供了技术支撑。