在该篇文章中，我们讨论了细胞基因组学方法，特别是scRNA-seq和scDNA-seq，将如何在临床上产生影响，重点关注肿瘤学、免疫学和血液学的应用。我们简要描述了相关的概念和方法，突出了最有可能影响临床实践的最新研究，讨论了将单细胞测序从研究环境转化到临床使用所需的下一步，以及在诊断实验室使用这些技术所面临的挑战。

临床转化单细胞方法

生成具有临床应用价值的单细胞序列数据有三个主要步骤（图 1）：以标准化的方式收集和处理组织样本，保持细胞的基因组特征；生成高特异性和高灵敏度的单细胞序列数据；最后，应用生物信息学方法将原始序列数据转化为临床可解释的发现。

图1 | 实施单细胞测序技术的关键步骤。样本收集、单细胞测序和生物信息学的三个关键阶段理想情况下应通过端到端的实验室管理系统（LIMS）进行管理。a，组织样本收集。对固体组织活检样本需要特别考虑，因为细胞必须分离成可活细胞悬浮液。对于液体活检，细胞通常需要从样本的其余部分中分离出来。单细胞悬浮液可以在单细胞RNA测序（scRNA-seq）或单细胞DNA测序（scDNA-seq）之前冷冻保存，从而显著改善运输物流和工作流管理。b，单细胞测序。有各种各样的单细胞测序技术和平台，主要使用基于板的或微流控系统。尽管基于板的方法在生成的数据深度方面有优势，但我们预计，由于成本较低、工作流程更简单、吞吐量更高以及在诊断实验室实施的障碍较低，微流控系统将是临床实践中最容易采用的。c，生物信息学。与整体基因组学方法一样，从单细胞测序产生的所有数据都需要在被解读为诊断报告之前，从原始数据转化为人类可读的“处理过的”数据。尽管单细胞生物信息学与整体基因组学生物信息学分享许多步骤，但在质量控制步骤需要额外考虑，以确保只保留来自高质量细胞的数据。BAL，支气管肺泡灌洗；CSF，脑脊液。

组织样本收集

单细胞测序平台需要准备单个细胞的悬浮液。尽管现在出现了允许从固定材料生成数据的检测方法，但当前的方法要求细胞必须是活的并且完整的，以减小操作对它们基因组特性的影响。因此，对于实体组织来说，快速隔离和通过机械和/或酶消化温和地分离成单个细胞类型是至关重要的。这应该尽可能地在标本收集时进行，通常在24小时内（7-12）。

液体活检样本，如血液，需要从其余成分中分离出相关的细胞部分。用于分离细胞的确切方案取决于目标细胞，但可能包括密度离心技术，使用磁性标记珠的磁性细胞分离，荧光激活细胞排序（FACS）和使用包括细胞表面标记物、大小和变形性等特征的微流体技术。其中一些方法已经在临床环境中使用。例如，包括 Ficoll–Paque 或 Lymphoprep 的密度离心方法，用于从全血或骨髓中分离初级人类外周血单核细胞（13,14）。

一旦从液体组织中分离出细胞或从实体组织中分离，它们可以使用含有诸如二甲基亚砜这样的冷冻保护剂的控制速率冷冻室和培养基进行冷冻保存。这增加了样本收集和生成单细胞数据之间的物流和工作流的灵活性。在测序之前，细胞可以被解冻和洗涤，其活力可以通过染料排除法可靠地测试（15）。

无论下游分析类型如何，细胞隔离技术是相同的，尽管由于 DNA 与 RNA 相比的更高稳定性，scDNA-seq 对细胞准备工作流的变化更为稳健。简单、经过验证的单一组织类型的方案对于临床转化至关重要。现在已经存在针对大多数组织类型的基于研究的方案，但很少有实体组织细胞准备方案已经在临床工作流中得到验证。

生成单细胞数据

有许多可用于 scRNA-seq 的方法。然而，对于临床实践，平台必须发展成更加用户友好、高通量和经济高效。捕获细胞中的 RNA 的技术可以分为微流体或板基方法，这取决于细胞是如何被隔离的。它们在成本、每个实验的细胞数量和易用性方面有所不同（表 1）。

表1 | 可用文库制备和捕获方法的总结

基于微流体的方法涉及将细胞封装到与 DNA 条形码珠一起的油滴中，这些珠子会捕获来自细胞的 RNA。然后为所有细胞生成 cDNA 并使用标准的下一代测序工作流进行测序。使用结果数据，可以通过使用条形码将 RNA 序列分配给单个细胞的生物信息学分析来确定单个细胞的 RNA 概况。微流体和微孔技术使得可以同时捕获成千上万个细胞，市场上有几个商业平台，包括 10x Genomics Chromium Controller、BioRad ddSeq、ICELL8 或 BD Rhapsody Lab。低通量的板基方法，如 Smart-Seq3，涉及使用手动选择或 FACS 在标准的 96- 或 384-well 板中隔离细胞。这些板用于执行高保真逆转录、模板转换和预扩增，以增加 cDNA 的产量。接下来，cDNA 文库被测序，使用与微流体系统中使用的类似的生物信息学技术确定 RNA 概况（16-19）。

除了捕获方法和涉及的细胞数量外，微流体和板基方法之间的关键区别之一是它们生成的转录组覆盖率。基于微流体的 scRNA-seq 方法通常使用 3' 或 5' 捕获和断裂方法，基本上提供转录分子的计数，但缺少诸如异构体变异和等位基因特异性表达等复杂信息。相反，板基方法生成关于整个转录组的序列信息，也称为全长转录本。尽管板基方法提供了额外的信息，如 RNA 剪接和异构体变异，细胞特性，如大小，细胞表面表达和散射性质，但它们在易用性和通量方面有显著的权衡。除非这些属性有重大变化，否则不太可能在临床工作流中实施全长单细胞转录方法。

scDNA-seq 使研究人员能够阅读基因组并在细胞水平上识别单个突变，如拷贝数异常和单核苷酸变异。尽管这些信息可以从转录组数据中推断，但这种数据类型的有限基因组覆盖意味着变异的估计通常不够准确。与 scRNA-seq 相比，scDNA-seq 技术较不成熟，目前市场上的商业解决方案很少（表 1）。

表1 | 可用文库制备和捕获方法的总结

scDNA-seq 分析已经在 Mission Bio Tapestri 平台上有效地展示过。这是一个定向的、高通量的基于滴式的系统，对于多达 5000 个细胞，其读取覆盖率> 90%，它被开发出来用于改善癌症中的患者分层、治疗选择和疾病监测。然而，仅仅基因分型并不能提供关于细胞身份或检查例如细胞分化和功能所需的其他表型信息。多模式测序（生成单细胞 DNA、RNA 和表观遗传信息）是解决这个问题的一个有吸引力的方法，它使得可以将体细胞突变与细胞的基因组特性联系起来。此外，单细胞 T 细胞受体（TCR）和 B 细胞受体（BCR）测序提供了一种独特的方法来检查免疫细胞组，并可以识别克隆扩增和多样性（20-26）。

目前，像 10x Genomics 和 Mission Bio 这样的单细胞技术正在临床实验室中出现，尽管可访问性有限。这些技术在国家质量控制框架内的标准化和认证是结果可靠性所必需的。单细胞方法必须与当前应用的现行金标准测试进行比较。例如，scRNA-seq 在识别微小残留疾病（MRD）方面的灵敏度和特异性将需要直接与当前用短串联重复（STR）PCR 检测水平进行比较。

生物信息学分析

一旦生成了序列数据，就会应用标准的生物信息学技术来转换原始数据并提取临床相关信息。这些步骤通常会成为验证和法规框架的一部分。计算步骤取决于序列数据是来自scRNA还是scDNA，典型的生物信息学步骤的深入评论已在其他地方发表过。我们预计，在大多数情况下，这些流程将适用于临床设置，但与分子工作流程一样，它们将需要在本地认证框架内进行验证（27-29）。

总之，尽管使用单细胞测序生成临床可行的数据存在相当多的障碍，但这些障碍并非不可逾越（补充表1），我们预计，单细胞基因组学能够为临床护理提供的益处，再加上快速的技术发展以最小化样本管理的成本和物流，将在未来几年中导致更广泛的应用。

补充表1 | 在诊断实验室实施细胞组学的实际考虑

单细胞技术在临床试验中的最近增长（框1和补充表2）是对这项技术如何可能被整合到临床研究和实践的有价值的预测。像人类细胞图谱这样的开源参考数据集的日益可用，将有利于生物信息学程序的验证，并增强细胞识别和分析。下文中，我们突出了一些即将进行临床转化的引人注目的应用实例（30）。

框1 细胞基因组学在临床试验中的变化作用

截至2022年12月，已有62个注册的临床试验在肿瘤学、血液学和免疫学领域采用细胞基因组学方法（见补充表2）。这些试验中的大多数都有探索性目标，例如发现生物标记物以便与标准治疗试验一同使用，或改进疾病的诊断和亚分类（如下方“应用领域”表中所总结的）。尽管探索性研究仍然至关重要，但明确专注于单细胞RNA测序（scRNA-seq）的实际应用以及其在诊断环境中使用的可行性的试验最有可能推动其在临床实践中的应用。

有趣的是，当前大多数试验都在使用scRNA-seq，或者是结合scRNA-seq和单细胞DNA测序（scDNA-seq），这可能反映了这项技术的成熟度，因为scDNA-seq在肿瘤学和血液学方面有着巨大的临床机会（如下方“测序类型”表中所总结的）。值得注意的是，这些临床试验中有85%主要是使用血细胞进行的，或者，在实体组织癌症的情况下，使用血细胞和肿瘤细胞的配对样本（补充表2）。这部分可以解释为实体组织解离仍然存在的挑战，尽管使用配对样本将实现验证研究，从而减少对实体组织活检的需求。我们预计这将很快成为临床试验设计的固有组成部分。

补充表2

补充表2 | 利用单细胞技术的所有当前开放的临床试验汇总。NHL – 非霍奇金淋巴瘤，ALL – 急性淋巴细胞性白血病，HSCT – 造血干细胞移植，GVHD – 移植物抗宾主病，AML – 急性髓系白血病，DLBCL – 弥漫性大B细胞淋巴瘤，CSF – 脑脊液，BM aspirate – 骨髓抽吸，CRC – 结直肠癌，NSCLC – 非小细胞肺癌，GBM – 多形性胶质母细胞瘤，HNSCC – 头颈部鳞状细胞癌，HCC – 肝细胞癌，NET – 神经内分泌肿瘤，ILD – 间质性肺病，HIV – 人类免疫缺陷病毒，NMO - 脊髓灰质炎光谱病，MG – 重症肌无力，CIDP - 慢性炎症性脱髓鞘多根神经病，GI – 胃肠道，scATAC-seq – 单细胞转座酶可及染色质测序检测

单细胞基因组学在血液病学中的应用

血液系统恶性肿瘤的特点是细胞异质性，而像治疗耐药细胞克隆和白血病干细胞这样的稀有细胞群体对疾病轨迹有着关键意义（图 2a）。

图2 | 单细胞测序在研究中的进展。单细胞测序对生物科学研究产生了巨大影响，特别是在揭示涉及人类疾病的细胞的新类型和功能方面。a， 在血液学方面，追踪克隆演化使得能够识别治疗抵抗性克隆和进行长期疾病监测。通过它们的基因组特征定义低频细胞群体的识别，也推进了对肿瘤干细胞和最小残留疾病监测的研究。b，在肿瘤学方面，几乎所有类型的癌症的细胞图谱都已经发表，这些图谱描绘了肿瘤内异质性和肿瘤微环境。与此相一致，人们在了解转移机制和通过循环肿瘤细胞的分析进行早期检测方面取得了重要进展。c，在免疫学方面，通过解析单个细胞的T细胞受体和B细胞受体测序，研究人员已经解析了潜在的致病免疫细胞的基因组机制，这些细胞可以是循环的，也可以是组织驻留的。与传统的流式细胞术技术相比，单细胞基因组方法在可以测定的参数数量上提供了数个数量级的增加，大大提高了发现的分辨率。

这些恶性肿瘤很容易适用于单细胞基因组学方法，因为从血液、骨髓和淋巴结创建单细胞悬浮液的标准化协议已广泛可用。实际上，血液科医生已经使用诸如流式细胞术和质谱细胞术的单细胞水平分析进行诊断，但这些方法仅限于分析少量蛋白质的表达。在这里，我们讨论了通过引入更高分辨率的细胞基因组学技术，可能改进的临床实践领域，这些技术可以将 plex 增加 100 倍，并具有比当前方法更高的定量准确性。

提高诊断和治疗选择的分辨率

新兴研究已经展示了单细胞测序改进血液系统恶性肿瘤诊断技术的潜力。一个关键的例子是 FLT3（FMS样酪氨酸激酶3）基因在急性髓系白血病中的早期诊断突变，这是一个众所周知的预后不良特征，与新兴的靶向治疗相关。对 FLT3 突变的测试在诊断时可能是阴性的，但在复发时是阳性的，这表明初始细胞群体中的突变水平低于当前常规检测方法的检测限制。最近的工作表明，scDNA-seq 即使在稀有细胞群体中也能够识别 FLT3 突变，比 bulk 测序提高了一个数量级的检测水平。我们认为，细胞基因组学技术可以在两个主要领域改善携带 FLT3 突变患者的管理。第一个是提高精确的早期诊断，因为针对这种突变的现有靶向治疗将有助于避免克隆扩张和疾病进展。第二个是疾病监测，因为从诊断到复发阶段对 FLT3 突变的克隆演化的准确信息可能有助于指导最合适的治疗决策（31-33）。

使用细胞基因组学分析单个细胞的能力也显示出作为一种敏感方法来早期诊断异源性（供体和受体细胞的基因型都存在）的潜力，这种方法用于白血病患者进行异基因干细胞移植后。测试异源性在帮助评估供体植入、检测排斥反应的早期迹象和监测最小残留疾病（MRD）方面具有重大临床价值。当前检测异源性的金标准方法包括使用 PCR 测试诸如短串联重复（STRs）这样的高度变异基因型，这可以保证1%的检测灵敏度。然而，使用更敏感的方法进行更早的检测可能通过使得更早的治疗干预成为可能而改善临床结果。基于宿主和供体转录组的差异，scRNA-seq 已经显示了在异基因干细胞移植后皮肤依然存在的宿主 T 细胞。尽管目前尚未发表，但随后的研究表明，与 STR 分析相比，scRNA-seq 在检测未成熟细胞群体中宿主细胞水平方面具有显著更高的灵敏度。一项临床转化的初步研究显示，scDNA-seq 通过准确量化宿主和供体细胞的基因型比例，可以跟踪植入和异源性。这些测试对于在异基因干细胞移植后1-2个月识别突变的 TP53 克隆足够敏感，这成功地预测了复发，当常规测试如爆发计数未检测到疾病进展时（34-39）。

单细胞测序还可能增强对以血细胞群体中体细胞嵌合体为特征的血液疾病的诊断，包括诸如 Fanconi 贫血或重型再生障碍性贫血这样的低细胞性疾病。在这些情况下，嵌合体的程度和基因组位置与疾病进展的长期率和总体预后密切相关。当前检测嵌合体的临床方法使用 bulk DNA 测序，其基因型依赖于测序覆盖率和杂合子的比例。然而，通过使用高通量单细胞测序，可以显著增加检测的灵敏度和准确性，同时可以分析更大的细胞群体来提高统计学的准确性。例如，对 Fanconi 贫血患者的单细胞 RNA 测序发现了多个基因型的存在，并与多样性和临床结果密切相关（40）。这导致了对嵌合体的低估，这在疾病的早期阶段或当无法进行细胞隔离时是无法检测的。直接应用scDNA-seq，主要使用目标捕获panel，将解决这两个挑战。

细胞基因组学还为改善靶向治疗和理解治疗对克隆演化的影响提供了新的机会。这个活跃的血液学研究领域已在表征异质性疾病（如髓系发育不良综合症、急性髓系白血病、骨髓衰竭和多发性骨髓瘤）方面取得了实质性进展。特别是，定义分子和基因特性以及识别治疗克隆选择已经取得了重大进展。这些研究中出现了一些反复出现的主题：第一是识别治疗诱导的克隆演化，第二是识别导致克隆演化和细胞行为变化的获得性突变。挑战在于推断血细胞中观察到的任何克隆事件的后果——称为具有不确定潜能的克隆性造血（CHIP），其中体细胞突变固定在少量细胞中。通过单细胞分辨率的深度多组学分析，可以改善区分与年龄相关的良性变化与早期恶性转化的能力，这归因于人类造血干细胞的转录组、蛋白质表达和表观遗传标记之间的不一致性。尽管整体方法可能敏感地检测到CHIP突变的存在，但需要对个体细胞进行表征，以确定恶性转化的确切潜能和发病机制，以适当地对患者进行分层。在髓系发育不良综合症中，显著的肿瘤内异质性与低细胞性结合，表明单细胞方法是表征疾病生物学的理想选择（41-48）。

特别关注确定体细胞克隆突变的顺序，早期工作展示了通过轨迹推断的克隆演化。通过识别关键的早期主干突变，可以使用针对恶性细胞亚克隆的特异性药物。最明显的例子之一是急性髓系白血病，其中scDNA-seq已能够在治疗过程中和复发时绘制驱动突变的克隆扩张，以确定对持续存在的治疗耐药细胞亚克隆的患者进行适当的治疗加强。同样，scRNA-seq已被用于评估白血病干细胞，这些细胞是表型上类似于健康造血干细胞的原始和静止亚群，但在急性和慢性髓系白血病中是治疗耐药的。此外，scRNA-seq可以表征B细胞急性淋巴细胞性白血病中MRD中的稀有细胞，包括分化状态和基因上调，具有识别治疗靶点的潜力（48-54）。

改进最小残留疾病的检测

单细胞分析在检测最小残留疾病（MRD）方面具有临床应用价值，无论是在进行诱导化疗或骨髓移植治疗血液恶性肿瘤后。MRD的检测指导治疗选择，改进的监测率将导致有益的临床结果和治愈的机会。例如，近期已经证明，scDNA-seq可以在急性髓细胞白血病治疗后识别MRD。scDNA-seq在细胞克隆分型的准确性使其达到了0.02%的低检测限，每位患者测序约8000个细胞（超过欧洲白血病网联盟1/1000细胞的检测限制），并比bulk下一代测序以更高的频率检测复发性MRD。与当前多重定量PCR检测的临床标准相比，scDNA-seq可以提高准确性和简便性。然而，在该技术能够变得容易进入临床之前，需要超高通量的方法，每位患者生成数十万个细胞的数据（见图3）（54-55）。

单细胞基因组学在肿瘤学中的应用

单细胞技术在实体癌症中的应用在许多方面与血液恶性肿瘤的应用原理相同。当今癌症治疗的主要方式是多模态治疗，包括手术、化疗、免疫治疗和放疗。尽管这对一些患者有效，但对许多其他患者来说，这些治疗的临床效益有限，并导致治疗相关的发病率。此外，众所周知，包括治疗耐药性、复发和毒性在内的各种临床结果，是由肿瘤、基质和免疫细胞群体之间的肿瘤内异质性导致的。在临床环境中，肿瘤内异质性带来了几个挑战，例如阻碍了对治疗耐药亚克隆的早期反应。此外，无法准确测量分子驱动因子和癌症干细胞的比例影响了治疗的效力。传统的bulk测序诊断技术难以量化这些特征，因为稀有细胞群体的基因组特征被掩盖了，推断肿瘤的细胞组成不精确。因此，单细胞测序技术有望在癌症领域产生临床影响，特别是通过解析实体组织肿瘤中细胞的分子信息和组成，更高分辨率的循环肿瘤细胞（CTCs）基因组分析和恶性细胞的精确克隆分型。我们预期，肿瘤学的几个领域，包括早期诊断和筛查、导向性治疗和针对肿瘤微环境的治疗，将受到细胞基因组学技术的影响（见图2b）（56-60）。

图2 | 单细胞测序在研究中的进展。单细胞测序对生物科学研究产生了巨大影响，特别是在揭示涉及人类疾病的细胞的新类型和功能方面。a， 在血液学方面，追踪克隆演化使得能够识别治疗抵抗性克隆和进行长期疾病监测。通过它们的基因组特征定义低频细胞群体的识别，也推进了对肿瘤干细胞和最小残留疾病监测的研究。b，在肿瘤学方面，几乎所有类型的癌症的细胞图谱都已经发表，这些图谱描绘了肿瘤内异质性和肿瘤微环境。与此相一致，人们在了解转移机制和通过循环肿瘤细胞的分析进行早期检测方面取得了重要进展。c，在免疫学方面，通过解析单个细胞的T细胞受体和B细胞受体测序，研究人员已经解析了潜在的致病免疫细胞的基因组机制，这些细胞可以是循环的，也可以是组织驻留的。与传统的流式细胞术技术相比，单细胞基因组方法在可以测定的参数数量上提供了数个数量级的增加，大大提高了发现的分辨率。

使用循环肿瘤细胞进行早期诊断和疾病监测

CTCs是从原发肿瘤中脱落，并出现在循环血液或淋巴系统中的肿瘤细胞，以单个细胞或小细胞团簇的形式存在。一旦进入循环系统，CTCs最终迁移到体内新的部位，要么保持休眠，要么形成转移瘤。尽管CTCs很少见 — 通常每1-1000万个白细胞中检测到一个CTC — 但有几种方法可以检测到并从血液中分离CTCs。一旦分离，单细胞测序技术可以揭示有价值的临床见解。最近的研究表明，通过仔细过渡到临床实验室，单细胞测序CTCs可以用于患者的早期检测，监测对治疗的反应，并可能指导治疗选择（61-65）。

重要的是要认识到，已经使用流式细胞术等技术在这些领域取得了改进，通过细胞表面标记物（如EpCAM）或癌症特异性生物标志物来识别和量化CTCs的丰度。例如，基于流式细胞术监测CTCs的存在已经被证明是一种宝贵的策略，对于肿瘤的重要早期检测尤为如此，特别是在乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝细胞癌、胰腺癌、结直肠癌和黑色素瘤中。然而，通过将单细胞基因组学技术应用于CTCs，可以获得更多数据，从而改善临床信息和结果。例如，单细胞测序已被用于识别乳腺癌患者中CTCs的增殖率差异，高增殖率与不良预后相关。同样，在从结直肠癌患者分离的CTCs中，单细胞测序识别了与细胞黏附和运动相关的基因组异质性。与更大的移动性和黏附性相关的签名与增加的死亡时间相关。在这两种情况下，细胞基因组学技术都识别了细胞表型 — 增殖和黏附 — 这些表型是传统的基于生物标志物的方法无法识别的（66-71）。

来自CTCs的基因组信息也可以用来帮助定制治疗方案。例如，对CTCs和原发肿瘤的转录组进行详细比较，已经确定了使CTCs能够在血流中存活并发展为转移性疾病的分子表型，为防止疾病传播提供了不同的治疗靶点。在实际应用中，CTCs的准确识别和基因组分析将使临床医生能够准确地监测早期癌症的复发，确定后续治疗的靶向治疗策略，无需连续组织活检，也可能允许对无法进行组织活检的肿瘤进行准确的首次诊断。此外，还可以实时用CTCs进行治疗耐药细胞的早期识别，实现实际的治疗定制和预后判断（72-75）。

通过分子筛查引导治疗

细胞毒性化疗药的选择历史上一直是由肿瘤部位和组织病理学特征的临床试验驱动的，而不是由细胞或基因组特征驱动的。然而，发现驱动突变和采用口服小分子酪氨酸激酶抑制剂或单克隆抗体的靶向治疗已经革命性地改变了许多癌症的治疗，例如人表皮生长因子受体2（HER2，由ERBB2基因编码）阳性乳腺癌和表皮生长因子受体（EGFR）突变的非小细胞肺癌。最近的策略是组织不同源的靶向治疗，治疗决策由分子特征决定，而不考虑组织来源。例子包括微卫星不稳定性的免疫治疗或神经营养性酪氨酸激酶（NTRK）融合阳性肿瘤的entrectinib治疗。这些策略基于从bulk测序方法识别的基因组特征，因此严重依赖于活检样本的细胞组成和解析多个细胞群体的基因组特征的能力。此外，即使平均蛋白质或基因组信号识别出相同的基因扩增，针对不同癌症中的相同分子驱动因子的靶向已被显示具有可变的结果，部分归因于局部细胞微环境的差异。例如，HER2定向治疗显著延长了乳腺癌的总生存时间，但在胃癌中的疗效有限，这与证实胃癌中存在多样性和耐药细胞群体的数据一致。在这些情况下，单细胞技术可以识别可靶向细胞的流行病学，并可用于基于肿瘤异质性制定个性化治疗决策（76-81）。

除了肿瘤中的转录异质性外，遗传异质性（又称为克隆性）也很常见。因此，基于bulk测序的分子引导治疗选择可能会错过肿瘤中的一些克隆。当可靶向突变仅存在于稀有克隆群体中时，这尤其正确。在这些情况下，基于panel的scDNA-seq可以提供比bulk测序方法更显著的优势，罕见克隆型的检测率是测序细胞数的函数。更细致了解肿瘤内克隆的遗传轮廓可用于指导靶向和联合治疗。

与提供肿瘤的克隆结构信息同时，scDNA-seq还可以绘制疾病的克隆演化，这作为纵向监测工具很有用，用以确定不同的细胞子克隆如何响应治疗，并描述从原发疾病到转移部位的异质性。在一系列癌症中，已经观察到治疗响应中克隆演化识别的有力例证，包括乳腺癌中克隆的治疗依赖性选择，结直肠癌中的获得性突变以及在用KRAS抑制剂治疗肺癌后出现的克隆抵抗异质性模式。我们预计，基于panel的scDNA-seq的临床应用将侧重于分子引导治疗选择，并且由于建立良好的测试程序和使用bulk测序方法进行基因组信息决策，而定位于快速临床转化。例如，假设一个肿瘤有一个带有ERBB2扩增的子克隆，但只代表了较小比例的细胞。在这种情况下，有可能靶向治疗只会影响肿瘤细胞的一部分。因此，受影响的肿瘤细胞的阈值可能预测总体治疗效果（82-84）。

细胞水平的基质细胞和浸润免疫细胞分辨率

免疫治疗已经改变了许多癌症的治疗格局，例如转移性黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌。然而，在当前实践中，只有一小部分患者能够获得持久的益处，还需要发现能有效预测患者反应的生物标志物。最常见的免疫组化试验用于免疫检查点调节蛋白PDL1，可以在肿瘤细胞或肿瘤浸润免疫细胞上使用；然而，在具有复杂微环境和高免疫浸润的肿瘤中，其有效性会减弱。解决肿瘤内部和微环境异质性一直是单细胞研究中的一项激活领域，大多数实体癌症已经进行了基质细胞和浸润免疫细胞的详细单细胞检查。其中，越来越多的研究表明，特异于细胞亚型的基因组特征可以预测检查点抑制剂免疫治疗的反应和毒性（图3）。虽然生成实施这些新生物标志物方法所需的单细胞数据类型仍然是一个挑战，但我们相信，由于生物标志物的细胞分辨率带来的优势，免疫治疗的疗效会得到提高，特别是对于像透明细胞肾癌和非小细胞肺癌这样具有复杂细胞生态系统的癌症（85-91）。

图3 | 将单细胞测序集成到临床实践中的好处。尽管我们预计从长远来看，单细胞基因组学很可能会影响临床实践的许多领域，但我们预计最初的重点领域将是肿瘤学、血液学和免疫学。a，单细胞技术可通过提高应用于循环肿瘤细胞的基因组分辨率来用于癌症的早期检测。b，越来越多的证据表明，特定免疫细胞亚群的细胞基因组特征可以用来预测检查点抑制剂免疫疗法的反应和毒性。c，细胞基因组学技术可以识别作为获得性免疫疗法抵抗机制的靶向HLA的选择性转录丧失。d，在一系列应用领域中，细胞基因组学技术在临床试验中的应用正在增长（见补充表2）。e，从最小残留疾病的分辨率提高到患者的亚分类和分层，诊断和监测的应用正在出现。f，细胞基因组学方法正被用来通过分辨克隆型和细胞亚群的基因组特征来识别新的治疗靶点。g，除了早期检测，深度基因组分析循环肿瘤细胞还可以用于监测癌症的演化。

通往临床转化更直接的途径涉及识别特定亚型的细胞，其存在和流行可以预测对免疫检查点阻断疗法的反应。最近一个明确的例子是通过对五种癌症类型的scRNA-seq数据进行元分析，发现CXCL13+CD8+ T细胞与对抗PD1疗法的有利反应之间的相关性。通过分析带有T细胞抗原特异性信息的scRNA-seq数据，显示测量CXCL13表达可以有效识别肿瘤内耗竭和非耗竭的肿瘤反应性CD8+ T细胞克隆。这种方法，将肿瘤反应性T细胞的基因组特征与旁观者T细胞分离，展示了单细胞技术相对于bulk方法所提供的更高分辨率带来的好处。一旦发现了细胞的特征——在这种情况下，是CXCL13+和CD8+——传统的细胞分型技术如流式细胞术和质谱法可以用于常规临床实践（92）。

探索免疫治疗耐药机制和采用T细胞治疗的发展是单细胞方法为免疫肿瘤学领域做出贡献的另外两个领域。例如，与免疫组化或bulk测序方法不同，scRNA-seq可以识别靶向HLA的选择性转录丧失作为获得性免疫治疗耐药的一种机制，从而实现针对性药物开发策略，以克服治疗耐药性（93）。

采用T细胞治疗，即输注特异性靶向癌症抗原的基因修饰T细胞，是高度个性化免疫肿瘤学的巅峰，并有望极大受益于将细胞基因组学转化为临床实践。单细胞TCR重排序列测序（scTCR-seq）结合scRNA-seq提供的外周血和肿瘤浸润淋巴细胞中异质性新抗原特异性TCR的快速和准确识别，表明这将是进一步发展该疗法的技术选择。此外，scRNA-seq识别癌细胞中的非遗传异质性的能力，包括细胞状态转换，可以允许针对比当前的bulk TCR测序技术识别出来的更广泛的癌症新抗原进行靶向治疗（94-97）。

单细胞基因组学在免疫学中

自从50多年前首次报道T细胞和B细胞之间的区别以来，免疫学领域一直致力于将淋巴细胞和其他免疫细胞进一步细分为越来越多的亚群，以确定它们在健康和疾病中的功能。通过解决这些群体内的异质性和多样性，单细胞分析已经迅速推进了这一工作，并生成了一个快速演变的循环和实体组织中免疫细胞图谱。scRNA-seq方法的一个独特特性是，可以从单个淋巴细胞确定TCR和BCR序列，使它们对研究免疫学疾病具有价值。TCR和BCR特异性是针对病原体的正常免疫反应的基础，但是对自抗原的非典型反应会导致自身免疫疾病，而对致敏原的特异性反应则会导致临床过敏症。目前，大多数过敏性和自身免疫性疾病的治疗基于非特异性的免疫抑制和免疫调节剂，这些剂会损害病原性和正常免疫克隆。当前的scRNA-seq研究有潜力使临床医生能够表征病原性克隆，使用它们的TCR和BCR序列作为明确的识别条形码，并使用它们的基因组特征来使用新的或现有的治疗剂有选择性地靶向细胞（图2c）（98-99）。

图2 | 单细胞测序在研究中的进展。单细胞测序对生物科学研究产生了巨大影响，特别是在揭示涉及人类疾病的细胞的新类型和功能方面。a， 在血液学方面，追踪克隆演化使得能够识别治疗抵抗性克隆和进行长期疾病监测。通过它们的基因组特征定义低频细胞群体的识别，也推进了对肿瘤干细胞和最小残留疾病监测的研究。b，在肿瘤学方面，几乎所有类型的癌症的细胞图谱都已经发表，这些图谱描绘了肿瘤内异质性和肿瘤微环境。与此相一致，人们在了解转移机制和通过循环肿瘤细胞的分析进行早期检测方面取得了重要进展。c，在免疫学方面，通过解析单个细胞的T细胞受体和B细胞受体测序，研究人员已经解析了潜在的致病免疫细胞的基因组机制，这些细胞可以是循环的，也可以是组织驻留的。与传统的流式细胞术技术相比，单细胞基因组方法在可以测定的参数数量上提供了数个数量级的增加，大大提高了发现的分辨率。

疾病生物学的特征描述

自身抗体的产生和自反应性T细胞的出现导致了自身免疫性疾病。这些都是系统性疾病，但一些疾病表现为特定组织的炎症。scRNA-seq研究主要关注局部炎症反应或对自抗原的异常系统性免疫反应。将单细胞测序应用于来自血液、脑脊液和炎症组织活检的细胞，已经在表征与疾病相关的细胞群体方面取得了重要进展，包括在类风湿性关节炎、狼疮性肾炎、银屑病性关节炎、多发性硬化症和炎症性肠病等病症中，鉴定组织浸润免疫细胞。这些群体的特征表征导致了新免疫亚集的发现，包括T辅助细胞，这些细胞被认为是组织常驻的、驱动自抗体产生的自反应性T辅助细胞，它们的循环对应物在几种自身免疫性疾病中都得到了证实。这些群体的新研究正在计划或进行中，以确定它们的病原性和在治疗选择中的重要性。scRNA-seq在鉴定对标准治疗有抵抗性的类风湿性关节炎的潜在治疗靶点方面表现出实用性。在一个引人注目的过敏性疾病例子中，scRNA-seq用于表征一位患有严重、难治性药物反应伴嗜酸性粒细胞增多和全身症状（DRESS）综合症的患者体内扩增的、多克隆T细胞群体。从受影响皮肤的淋巴细胞分析揭示了它们的高活化状态，由JAK3和STAT1的上调驱动。这反过来建议了JAK抑制剂tofacitinib作为一种治疗选项，这对减轻疾病负担产生了显著效果（100-110）。

对致病性自反应性TCR和BCR组合的scRNA-seq研究表明了不同疾病所特有的克隆性和细胞异质性。例如，研究导致1型糖尿病（T1DM）的致病性T细胞，表明T1DM是由于各种各样的致病性免疫细胞引起的；因此，针对单一TCR序列的疗法将不会有效。另一方面，scRNA-seq被用来展示在先前定义的亚群（T辅助17细胞（TH17细胞））内的细胞异质性，以鉴定选择性驱动自身免疫性脑炎的致病性细胞，这使研究人员能够开发不会抑制健康免疫细胞的靶向治疗。scDNA-seq在干燥综合症患者的致病性自抗体产生的B细胞中鉴定了淋巴瘤驱动基因的体细胞DNA突变。这表明了免疫耐受检查点逃逸的一种机制，并表明一些自身免疫性疾病可能代表淋巴样肿瘤的前恶性状态。在类风湿性关节炎和多发性硬化症患者的CD8+ T细胞中也鉴定出了体细胞DNA突变。自身免疫性疾病的发病机制和基础机制仍然理解不足。单细胞方法研究免疫系统并精确鉴定淋巴细胞克隆的能力可能会彻底改变我们对这些复杂疾病的诊断和治疗方法（111-114）。

当前的障碍和未来的方向

目前，单细胞基因组学的已发表工作仍然坚定地处于研究领域。我们重点关注我们预期可以转化为临床实践的应用。然而，我们下面提到了几个重要的——但并非无法克服的——临床实施必须首先克服的障碍。

样本采集、储存和处理

大多数细胞技术要求新鲜的、活的细胞进行测序。尽管总是担心患者会觉得重复进行活检检测的想法令人生畏，但研究确实表明，如果这会影响他们的护理，患者愿意这样做。为了实现细胞捕获和测序，需要前期投资设备和人员，处理样本、准备文库和运行适当的分析需要技术专长。此外，还需要员工培训和认证，以满足严格的质量要求。

新鲜的组织活检样本必须迅速进行细胞测序，通常在几小时内。这将需要临床病理实验室摆脱甲醛固定的范式转变。尽管这代表了一个重大的变化，但可以从1980年代流式细胞术引入临床实践中吸取经验教训。为流式细胞术收集的样本在特定的培养基中收集，并在实验室内快速分析。专业人员、技术进步和自动化报告已经使这些结果成为多个领域临床医学的常规部分。在细胞基因组学领域，已经出现了一些将平滑实施过程的新兴技术，包括商业上可获得的冷冻培养基、患者样本的多重化和细胞RNA固定技术。

生物信息学分析

以可复制、高效的方式处理数据是将细胞技术应用于临床的一大障碍。为了实现结果的可复制性，实验室必须有标准的细胞过滤和标准化过程。此外，使用参考数据集的自动细胞分类将确保结果的稳健性。在大多数国家，新技术都是在国家法规框架内进行标准化和验证的（例如澳大利亚的国家测试机构协会），并且敏感性和特异性都是以当前的金标准测试为基准的。最初，具有丰富经验的参考实验室应处理数据，随着临床需求的增加，可以分享专业知识（115）。

结果的返回给临床医生

将大量的细胞基因组数据压缩成清晰、简洁且临床有用的报告是必要的。全外显子测序已在肿瘤学中变得普遍，有一些指南帮助实验室将报告定制给临床医生。尽管在细胞领域会有新的挑战，因为报告还必须考虑到细胞异质性，但当前可用的指南将提供有用的框架（116）。

成本

虽然目前细胞技术的成本相对较高，但我们从全外显子测序中看到这些成本随时间可以降低。根据国家人类基因组资源研究所的数据，在21世纪初，测序一个人类基因组的成本约为100万美元，而20年后，这一成本不到1000美元。细胞技术各方面的技术、方法、策略和试剂的进步将随着这些方法融入临床而降低成本。

结论

单细胞分辨率的基因组测序革新了我们对血液学和实体器官恶性肿瘤的理解。它描绘出肿瘤异质性和微环境，识别出多个组合治疗的靶点，预测对治疗的反应和毒性，并揭示治疗抗性的机制。单细胞测序在开发自身免疫疾病的精准治疗方面表现出潜力，也用于患者分层、疾病监测和精确诊断（图 3）。未来的研究应优先寻找解决财务和法规障碍的实际解决方案，以实现这项技术的广泛临床应用。评估单细胞测序在诊断和识别可靶向突变以指导治疗决策方面的能力的临床试验将是其转入临床实践的关键。

图3 | 将单细胞测序集成到临床实践中的好处。尽管我们预计从长远来看，单细胞基因组学很可能会影响临床实践的许多领域，但我们预计最初的重点领域将是肿瘤学、血液学和免疫学。a，单细胞技术可通过提高应用于循环肿瘤细胞的基因组分辨率来用于癌症的早期检测。b，越来越多的证据表明，特定免疫细胞亚群的细胞基因组特征可以用来预测检查点抑制剂免疫疗法的反应和毒性。c，细胞基因组学技术可以识别作为获得性免疫疗法抵抗机制的靶向HLA的选择性转录丧失。d，在一系列应用领域中，细胞基因组学技术在临床试验中的应用正在增长（见补充表2）。e，从最小残留疾病的分辨率提高到患者的亚分类和分层，诊断和监测的应用正在出现。f，细胞基因组学方法正被用来通过分辨克隆型和细胞亚群的基因组特征来识别新的治疗靶点。g，除了早期检测，深度基因组分析循环肿瘤细胞还可以用于监测癌症的演化。

可行性试点试验应专注于为新鲜组织收集和快速处理制定一致的协议，以及简化的数据分析流程，以确保结果以标准化的格式呈现给临床医生。例如，终点可以包括在指定时间内处理的样本数量或临床医生对结果格式的满意度。此外，还应收集从组织收集到生物信息学处理的成本、人员和基础设施需求的数据，以指导未来的发展和投资。展示可行性至关重要，因为如果这一点没有确定，就很难证明进行更广泛的试验来评估效能和有效性是合理的。

这些学科中的大多数当前临床试验仍处于探索阶段，只有一项研究专门检查了可行性。下一个挑战是将单细胞技术从实验研究转移到具有实际应用的临床试验，以评估可行性和效能。此外，当前识别新治疗靶点的研究需要转化为药物开发和实践。

我们预测，对诊断和治疗目的的临床效益的试验证据将改变我们对精准医学的方法，并且单细胞测序将在未来十年成为诊断过程的关键组成部分。

译者：Dr. Wang

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