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一文读懂 ChIPseq
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文章目录
一、介绍二、测序原理三、检测蛋白质与DNA序列的结合峰1、测序片段匹配到参考基因组2、检测峰3、提高峰质量
四、影响ChIPseq测序结果的因素1、免疫共沉淀的影响2、测序的影响测序深度的对组蛋白修饰检测的影响3、重复样和重现性
一、介绍
ChIP-seq，测序方法
ChIP 指染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP），seq 指的是二代测序方法 作用：识别蛋白质与DNA互相作用情况原理：染色质免疫共沉淀 + 二代测序应用：常用于转录因子结合位点和组蛋白修饰位点的研究
二、测序原理
1、使用甲醛将目标蛋白（组蛋白，转录因子等）与染色质交联固定起来
2、从细胞裂解液分离基因组DNA，通过超声打断DNA为一定长度的小片段
3、添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体会与目标蛋白形成免疫结合复合体沉淀，收集这些沉淀 免疫结合复合体 = 靶蛋白 + 抗体 + 靶蛋白结合的DNA
4、去交联，分开蛋白与DNA，纯化DNA即可得到染色质免疫沉淀的DNA样本
5、建立好文库，用测序仪进行测序 详细测序过程可以参考：https://zhuanlan.zhihu.com/p/58708887
将测序得到的 DNA 片段（sequenced fragments）匹配到参考基因组。 很显然，如果在基因组的某个位置蛋白质结合的概率越大，那么在该位置检测到 DNA 片段堆叠就会越高。反之，如果没有蛋白结合，在该位置就会几乎没有DNA 片段堆叠。为了研究方便，我们将这些DNA片段堆叠叫做峰 (Peak)。
将覆盖到参考基因组的DNA片段堆叠用柱状图画出来，就会看到峰。 这里需要知道，ChIPseq是利用抗体去结合特异的靶蛋白，进而去沉淀靶蛋白结合的DNA。理论上，只要抗体设计的好，与蛋白质结合的 DNA 的都可以检测到。 我们一般用 ChIPseq 检测转录因子的结合，以及检测组蛋白修饰，二者有着截然不同的峰形： 转录因子结合的特征峰，峰型高，而且窄：
组蛋白修饰结合的特征峰，峰型起伏，而且分布广泛：
当然我们也可以使用，UCSC基因组浏览器显示。
一般在做ChIPseq时，会加入一组空白对照（control），提高峰质量，那么为什么？ 一般检测出的峰值会有背景噪音，也就是文库会夹渣一些没有用抗体捕获的DNA片段也被测序了。开放的染色质区域比封闭的区域更容易断裂序列在基因组中分布不均允许我们在比对的控件中与相同区域进行比较消除 ENCODE 的 Black list的影响所以会准备空白对照，排除假阳性，对照组有有两种类型： input DNA：不用任何抗体捕获的DNA；mock IP DNA：用不含有抗体的DNA这样一来，就会让我们检测到的峰更明显更接近真实的生物学特征。 四、影响ChIPseq测序结果的因素 1、免疫共沉淀的影响 高效特异性抗体起始样本量ChIP DNA 产量 细胞类型标记或蛋白质丰富程度（组蛋白比TF具有更高的结合覆盖率）抗体质量对于组蛋白，使用来自T细胞的20ug染色质DNA作为起始材料，总共会得到15-50ng DNA。 对于TF，通常从2500万个细胞（200ug染色质）中得到5-25ng。 -Subhash Tripathi，ResearchGate 染色质片段 片段大小：影响ChIP-seq中的信噪比因细胞类型而异偏向启动子区域的片段会在ChIP 和对照样品中的启动子上引起ChIP-seq富集 2、测序的影响 Reads 长度 较长的 Reads 和双末端 Reads 可提高匹配率对于等位基因特异性染色质事件，转座因子研究是必需的 避免分批次序列输入对照的深度等于或大于IP样本测序深度 对于转录因子：最小5-10M对于组蛋白修饰宽谱图则更高：标准为20-40M 测序深度的对组蛋白修饰检测的影响下面是在不同测序深度下检测人的 H3K4me3 组蛋白修饰ChIP图谱。 绿色框对应于基于SPP宽峰检测方法得到的显著富集区域。 在 5M (500 Reads) 中，未检测到突出显示的富集区域。
同样，我们换成 H3K27me3 组蛋白修饰。 这时在3.5M和10M 的低深度处未检测到突出显示的HOXD11和HOXD-AS1基因座处的富集区域（蓝色框）。 从每个子样本中H3K4me3，H3K36me3和H3K27me3回收的全部数据中获得的显著富集区域的百分比 总的来说，随着测序深度增加，组蛋白修饰检测比例开始会快速增加，随后达到平稳。测序深度饱和点取决于组蛋白修饰和所研究的物种基因组。 3、重复样和重现性 重复多次通常比更高的深度更有效最好是低深度测序高质量样本，而不是高深度低质量样本参考： https://academic.oup.com/nar/article/42/9/e74/1248114 https://en.wikipedia.org/wiki/ChIP_sequencing#/media/File:Chromatin_immunoprecipitation_sequencing.svg https://www.abcam.com/epigenetics/studying-epigenetics-using-chip |
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