仲念念,朱伶俐,王 旋,房 娜

(1.河南大学医学院,河南开封475004;2.南京大学生命科学学院,江苏南京210046)

TAZ基因重组质粒的构建与表达

仲念念1,朱伶俐2,王 旋1,房 娜1

(1.河南大学医学院,河南开封475004;2.南京大学生命科学学院,江苏南京210046)

摘 要:目的构建重组质粒TAZ-pcDNA3.1及TAZ-p EGFP-C2,并应用Western Blot检测TAZ蛋白在细胞内的表达情况,初步探索TAZ分子促进细胞增殖和迁移的作用机制。方法通过PCR扩增获得TAZ基因片段,胶回收后连接T载体,蓝白斑筛选,转化,提质粒,酶切,用T4 DNA Ligase连接,亚克隆进入pEGFP-C2和pcDNA3.1获得新的重组质粒,分别转染HEK293细胞,智能型荧光细胞监测仪观察TAZ分子在细胞内的分布情况,Western Blot检测其在细胞内的表达情况。结果重组质粒经双酶切鉴定和测序证明构建成功,荧光照片显示TAZ分子分布在细胞核和细胞浆中,Western Blot检测结果表明转染有重组质粒TAZ-pcDNA3.1的HEK293细胞中有大量TAZ蛋白表达。结论成功构建了两种重组质粒,并初步验证了TAZ蛋白的细胞定位,为进一步研究其促进增殖和迁移的作用机制奠定了基础。

关键词:TAZ基因;重组质粒;HEK293细胞

Hippo信号转导通路在调节细胞增殖和凋亡中具有重要作用,与肿瘤的发生发展具有密切的关系[1]。TAZ分子是转录共激活因子,是Hippo信号通路中的一个靶点,作为14-3-3蛋白的结合蛋白发挥作用,因为它有着WW结构域,也被称为WWTR1[2]。在癌细胞中,TAZ分子的表达量很高,如人乳腺癌细胞系、胃癌细胞、非小细胞肺癌等,其过表达引起的形态学改变细胞转化的特性,促进细胞的增殖、迁移和侵袭[3]。TAZ分子在不同的细胞中的分布不同,有的分布在细胞浆中如原发性乳腺导管癌细胞,有的分布在细胞核中如骨转移瘤细胞[4-5]。因此,明确TAZ蛋白的亚细胞定位有助于阐明其促进增殖和迁移的作用机制。本实验构建了重组质粒TAZ-p EGFP-C2及TAZ-pcDNA3.1,并初步检测了TAZ蛋白的表达情况和细胞定位,为进一步阐明TAZ蛋白促进增殖和迁移的作用机制奠定了基础。

1.1细胞、质粒载体和菌株

HEK293细胞由河南大学医学院细胞与免疫实验室惠赠;含TAZ基因的质粒PET28a-TAZ(武汉三鹰生物技术有限公司);质粒pcDNA3.1和p EGFP-C2以及感受态大肠杆菌TOP10为本实验室保存。

1.2主要试剂与仪器

内切酶EcoRⅠ、Bam HⅠ、T4 DNA Ligase、LA Taq聚合酶、T载体连接试剂盒(日本Ta KaRa公司);质粒提取试剂盒、DNA产物纯化试剂盒、DNA Marker(上海莱枫生物科技有限公司);Lipo2000(美国Invitrogen公司);兔抗人TAZ多抗(武汉三鹰生物技术有限公司);HRP标记的羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司);PCR扩增仪、二氧化碳细胞培养箱(美国Thermo公司);WD-9413B紫外凝胶成像分析仪(北京市六一仪器厂);Ju LI智能型荧光细胞监测仪(韩国NanoEn Tek公司)。

1.3引物设计与PCR产物扩增

根据GeneBank中TAZ的基因序列(Gene ID: 25937)设计引物:T1:5'-GAATTCATGAATCCGGCCTCGGCGCCCC-3',5'端引入ECORⅠ酶切位点; T2:5'-GGATCCTTACAGCCAGGTTAGAAAGGGC-3', 5'端引入Bam HⅠ酶切位点。引物由苏州金唯智生物工程公司合成。以质粒PET28a-TAZ为模板,通过PCR扩增获得目的片段。PCR的反应条件为: 94℃预变性5 min;30个循环扩增:94℃(45 s),58℃(45 s),72℃(90 s);循环结束后,72℃延伸5 min,16℃降温10 min。取PCR反应液5μL,10 g/ L琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4构建重组质粒

将目的片段与T载体16℃水循环连接过夜,转化入感受态TOP10细胞,铺板,蓝白筛选,挑取白色单克隆菌落,37℃摇菌过夜,提质粒,用EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切鉴定,并送上海生工生物工程有限公司测序。将测序正确的TAZ-T载体质粒和质粒pc DNA3.1及p EGFP-C2分别用EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切,电泳,胶回收目的片段。将回收的TAZ片段分别和回收的pcDNA3.1及p EGFP-C2酶切片段16℃水循环连接过夜,转化,挑阳性克隆,摇菌,提质粒并用Eco RⅠ和Bam HⅠ酶切鉴定,将鉴定正确的重组质粒―20℃贮存备用。

1.5观察TAZ分子细胞定位

参考转染试剂Lipo2000的使用说明书进行操作,用Lipo2000将新鲜提取的重组质粒TAZ-p EGFP-C2转入70%融合的HEK293细胞中,培养36 h后用荧光细胞监测仪观察重组质粒的转染效率及TAZ分子在细胞内的分布情况。

1.6检测TAZ蛋白表达水平

用转染试剂Lipo2000分别将新鲜提取的重组质粒TAZ-pcDNA3.1和质粒pcDNA3.1转入80%融合的HEK293细胞中,并设置无转染试剂的空白对照和只加入转染试剂的阴性对照。培养48 h后分别收集细胞,提蛋白,体积分数为10%SDS-PAGE电泳, PVDF膜转印,用50 g/L的奶粉按1∶750的比例稀释TAZ抗体,4℃摇床孵育过夜。按1∶10 000的比例稀释二抗(羊抗兔抗体),室温孵育1 h,在膜上滴ECL发光液,暗室中压片曝光。

2.1PCR扩增产物

PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳可观察到在1 000 bp和2 000 bp之间有特异性条带,大小与TAZ基因相符(1 400 bp),见图1。

2.2重组质粒酶切鉴定

TAZ连接T载体经蓝白筛选,挑取白色单克隆菌落摇菌后送去测序,测序结果正确。TAZ-p EGFPC2和TAZ-pcDNA3.1酶切后经琼脂糖凝胶电泳观察结果为两条带,一条带约为1 400 bp,一条约为5 000 bp,符合预期结果。见图2。由此结果表明重组质粒TAZ-p EGFP-C2和TAZ-pcDNA3.1构建成功。

2.3TAZ分子细胞定位观察

重组质粒TAZ-p EGFP-C2转染HEK293细胞48 h后,用荧光细胞监测仪观察绿色荧光。TAZ蛋白弥散分布于细胞质与细胞核中,细胞核中更为集中。见图3。

2.4TAZ分子蛋白表达水平

Western Blot检测TAZ表达情况结果见图4。从图4中可以看出TAZ抗体检测结果为转染TAZ-pc DNA3.1的细胞蛋白表达量明显多于转染空载体pcDNA3.1和未转染的细胞表达量。

Hippo信号转导通路可以调控细胞内环境,其调控作用失调时就会引起癌症的发生,而TAZ分子是此通路中一个重要调控靶点,其促进细胞增殖和迁移的机制需要进一步探究[6]。

TAZ是一个转录共激活因子,进入细胞核与转录因子结合激活转录因子活性促进基因表达[2]。实时监测TAZ的亚细胞定位是研究TAZ分子促进细胞增殖和迁移机制的一个重要的实验手段。我们的实验所采用的p EGFP-C2载体,其加强型的GFP标记在所表达蛋白的N端,这样即可以方便检测带有EGFP标签的目的蛋白,与转染细胞自身表达或诱导表达的TAZ蛋白进行区别,而且不需要处理转染细胞,可以直接在荧光显微镜下观察标签蛋白的亚细胞定位。

我们成功构建了真核表达质粒TAZ-p EGFP-C2和TAZ-pcDNA3.1。在今后的研究中,运用该真核表达质粒不仅可以直接采用荧光显微镜探讨影响TAZ亚细胞定位的因素,也能用Western Blot法检测TAZ的蛋白表达水平,为探讨TAZ分子促进细胞增殖和迁移的机制提供了实验材料。

参考文献:new look at a key pathway in cell growth and transformation[J].Cell Cycle,2010,9(12):2 292―2 299.

[2]Ferrara A M,De Sanctis L,Rossi G,et al.Mutations in TAZ/WWTR1,a co-activator of NKX2.1 and PAX8 are not a frequent cause of thyroid dysgenesis[J].J Endocrinol Invest,2009,32(3):238―241.

[3]Guo L,Teng L.YAP/TAZ for cancer therapy:Opportunities and challenges(Review)[J].Int J Oncol,2015,46 (4):1 444―1 452.

[4]Shi P,Feng J,Chen C.Hippo pathway in mammary gland development and breast cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2015,47(1):53―59.

[5]Vici P,Mottolese M,Pizzuti L,et al.The Hippo transdu cer TAZ as a biomarker of pathological complete response in HER2-positive breast cancer patients treated with trastuzumab-based neoadjuvant therapy[J].Oncotarget, 2014,5(20):9 619―9 625.

[6]Mc Neill H,Sudol M,Halder G,et al.The Hippo tumor suppressor pathway:a report on the Second Workshop On The Hippo tumor suppressor pathway'[J].Cell Death Differ,2011,18(8):1 388―1 390.

[责任编辑姬 荷]

[1]Fernandez L A,Kenney A M.The Hippo in the room:a

Construction and expression of recombinant plasmid TAZ-pcDNA3.1 and TAZ-pEGFP-C2

ZHONG Niannian1，ZHU Lingli2，WANG Xuan1，FANG Na1（1.Medical College of Henan University，Kaifeng，Henan 475004，China；2.College of Life Science of Nanjing University，Nanjing 210046，China）

Abstract：ObjectiveTwo recombinant plasmids，TAZ-pcDNA3.1 and TAZ-p EGFP-C2，were established.The protein expression of TAZ in HEK293 cells was detected by Western Blot and the roles of TAZ in promoting cell proliferation and migration were further explored.MethodsAZ gene was amplified by PCR，fragments were recovered followed by connection with glue T carrier，blue-white screening，transformation and extraction of plasmid DNA.Then the plasmid DNA was digested，connected by T4 DNA Ligase，and then sub-cloned into p EGFP-C2 and pcDNA3.1 to construct new recombinant plasmids.These plasmids were transfected into HEK293 cells to observe the distribution of TAZ using a fluorescence detector.The protein expression was detected by Western Blot.ResultsBy restriction enzyme identification and sequence analysis，the recombinant plasmids were successfully constructed.Fluorescent photos show that the distribution of TAZ molecule was in the nucleus and cytoplasm.Western Blot test results showed that TAZ molecule could induce over-expression of specific proteins.ConclusionTwo recombinant plasmids were successfully constructed.The effects of TAZ over-expression were validated，which will lay a foundation for revealing the mechanism of TAZ in promoting cell proliferation and migration.

Key words：TAZ gene；The recombinant plasmid；HEK293 cells

作者简介:仲念念(1995―),男,河南驻马店人,在校本科生,从事基础及口腔医学的学习与研究工作。

基金项目:河南大学校内科研基金(2011YBZR007)。

收稿日期:2015-03-01

中图分类号:Q786

文献标识码:A

文章编号:1672―7606(2015)02―0111―04

河南大学学报（医学版）2015年2期