艾滋病(Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)是由人免疫缺陷病毒(Human immuno-deficiency virus，HIV)引起的一种逐步摧毁人体免疫系统、严重威胁人类健康和生存的重大传染性疾病。发现30多年来，至今仍无法彻底治愈[1-3]。许多研究致力于发现新型的抗HIV病毒药物和治疗方案[4-6]。

HIV-1在体内的复制可通过病毒颗粒感染靶细胞或者通过已感染HIV的细胞感染靶细胞。后者称为细胞介导的病毒传播途径，许多研究认为该途径对HIV体内传播非常重要，其感染效率比病毒粒子感染高出多个数量级[7-10]。因此，阻断该传播途径对HIV的治疗有重大意义。

细胞与细胞融合系统是筛选细胞介导的HIV传播阻断剂的有效手段。目前具有融合阻断作用的上市药物为T-20和Maraviroc (Mar)，这些药物已经存在耐药性等问题[11-13]。许多研究建立了不同效应细胞-靶细胞的融合系统，采用不同的HIV Env质粒和不同的检测指标[14-18]，有的研究报道发现了一些具有融合抑制作用的化合物[14, 17, 19]，但没有深入研究的报道。曾祥凤等[20]建立的将H9慢性感染细胞和MT2细胞进行细胞融合的筛选方法，需要加入钙荧光素，其可能对细胞生长有影响，而且融合和非融合细胞均有绿色荧光，靠人为区分，主观因素大，背景值高，终点检测用p24试剂盒，价格昂贵，成本高。李珉珉等建立了基于细胞-细胞融合的HIV进入抑制剂非感染性筛选方法，将两种细胞融合后，直接观察合胞体的形成[21]，该方法灵敏性不高，主观因素大。

HIV的包膜蛋白gp120和gp41，非共价结合成三聚体，在病毒表面或感染的细胞表面形成突起。在辅助受体CCR5或CXCR4等协助下，gp120蛋白识别靶细胞的CD4分子并与其结合，gp120与gp41分离，gp41构象发生变化，暴露出融合功能区并插入到靶细胞膜中，导致病毒包膜或感染的细胞膜同靶细胞膜的融合[22-24]。HIV的Tat蛋白在细胞蛋白复合物的参与下，与HIV的长末端重复序列(LTR)中的TAR RNA相互作用，调节HIV基因的表达。TZM-bl细胞株来自子宫颈癌细胞HeLa，高表达CXCR4分子，稳定表达CD4分子和CCR5分子。该细胞导入了荧光素酶报告基因和大肠杆菌β-gal报告基因，由LTR控制。Tat蛋白与LTR结合可诱导报告基因表达。

本研究建立了一种高效筛选HIV细胞融合抑制剂的检测方法(图 1)。首先构建了表达GFP蛋白和Tat蛋白的表达载体，该质粒与HIV的Env质粒共转染HEK-293T细胞，获得高表达HIV-1包膜蛋白和Tat蛋白的效应细胞。TZM-bl细胞作为靶细胞。当两种细胞共培养时，效应细胞表面的包膜蛋白识别结合靶细胞的CD4、CCR5和/或CXCR4受体，两种细胞发生融合，Tat蛋白扩散到靶细胞，激活报告基因，产生两种报告蛋白β-半乳糖苷酶和荧光素酶。通过蓝斑计数或荧光素酶检测反映融合情况。当两种细胞融合时，加入待测样本，如果报告基因表达减弱或缺失，则说明该样本具有阻断细胞融合的作用。用已明确作用靶点的HIV上市药物评价了该筛选系统，证明该方法可有效测定药物是否具有细胞融合抑制特性。

HEK-293T细胞、TZM-bl细胞由中国疾病控制中心病毒病研究所惠赠。质粒HIV-NL4.3和HIV-1 B亚型包膜质粒pREJO4541.67 Env (编号为11035，本文以11035-Env表示)由NIH AIDS Reagent Repository获得。质粒HIV-NL4.3携HIV-1 B亚型毒株全长基因组，用以获取tat基因序列，质粒pREJO4541.67 Env表达HIV-1包膜蛋白Env基因序列。

pGEM-T载体和pEGFP-C3载体、反转录试剂盒、转染试剂FUGENE 6、Bright-glo荧光素酶检测试剂盒等购自Promega公司；BamH Ⅰ、Xho Ⅰ限制性内切酶及PCR相关试剂购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；CCK8试剂盒购自日本同仁化学研究所。引物合成及基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。亚铁氰化钾、铁氰化钾等化学试剂购自国药集团化学试剂北京有限公司。

Mar、AZT、Raltegravir (Ral)购自MCE公司。Myr购自国药集团化学试剂北京有限公司；HZ、BS、QQ购自北京同仁堂药店；HPB、KH为本实验室合成；ZL-1为进行临床Ⅱ期测试的药物。

引物设计：以HIV-1 NL4.3的tat基因序列为模板，设计、合成引物，扩增含有两个外显子的tat基因序列。上游引物为：5′-CTCGAGAGCCAC CATGGAGCCAGTAGATCCT-3′，引入XhoⅠ酶切位点；下游引物为：5′-GGATCCAATTCCTTCGGG CCTGT-3′，引入BamHⅠ酶切位点。

pEGFP-Tat质粒的构建：从转染了HIV-1 NL4.3质粒的HEK-293T细胞中提取总RNA，以该RNA为模板，RT-PCR扩增tat基因，纯化回收PCR产物，连接到pGEMT载体，构建pGEMT-Tat质粒。将pGEMT-Tat质粒进行XhoⅠ、BamH Ⅰ双酶切，回收纯化tat酶切片段。tat的回收产物和pEGFP-C3载体连接、转化、扩增提取，得到pEGFP-Tat质粒，该质粒进行酶切及测序鉴定。

取对数生长期HEK-293T细胞接种六孔板。第2天将pEGFP-Tat质粒和11035-Env包膜质粒转染HEK-293T细胞，制备效应细胞。第3天取对数生长期的靶细胞TZM-bl接种到96孔板。第4天，收集转染了质粒的HEK-293T效应细胞，制成单细胞悬液，加入接种有TZM-bl细胞的96孔板中，两种细胞共培养24 h后，荧光显微镜摄像(Observer A1，Zeiss，德国)。报告蛋白β-半乳糖苷酶用蓝斑染色试剂检测[25]，用1%甲醛，0.2%戊二醛固定液固定样本，用2 μmol/L亚铁氰化钾、0.2 μmol/L铁氰化钾、2 μmol/L氯化镁、40 μg/mL X-gal染色液染色，荧光显微镜(IX71，Olympus，日本) ImagPro软件进行蓝斑计数。荧光素酶检测按照Bright-glo荧光素酶试剂盒步骤操作，多功能酶标(Enspire，PE，美国)测定荧光素酶值。

优化HEK-293T效应细胞的制备条件：取对数生长期HEK-293T细胞按照3×105个细胞/孔接种六孔板。第2天，将pEGFP-Tat质粒和11035-Env质粒转染HEK-293T细胞。根据tat:env质粒不同的量设不同实验组，24 h、48 h、72 h荧光显微摄像及流式细胞术测定转染情况，确定最佳转染条件。

将对数生长期TZM-bl靶细胞制备成单细胞悬液，加入96孔培养板，每孔10 000个细胞，贴壁0、2、6、24 h时加入效应细胞，共孵育24 h，荧光显微镜摄像及报告基因检测测定细胞融合情况，确定靶细胞最佳贴壁时间。

对数生长期的TZM-bl细胞按照10 000个/孔接种96孔板，贴壁24 h。将HEK-293T效应细胞制成单细胞悬液，按照效应细胞和靶细胞数目比例为0.5:1、1:1、2:1、4:1的比例加入96孔板中，两种细胞共培养24 h后，荧光显微镜摄像及报告蛋白检测测定细胞融合情况，确定两种细胞最佳比例。

将HIV-1上市药物Mar、AZT和Ral 10倍比稀释成一系列的浓度梯度，与效应细胞同时加入靶细胞中孵育。同时设立融合阳性对照组(FC，只有效应细胞和靶细胞孵育)和空白对照组(Mock，只转染了pEGFP-Tat质粒的HEK-293T细胞和靶细胞孵育)。24 h后，用蓝斑染色法和荧光素酶法分别测定细胞融合情况。

取对数生长期TZM-bl细胞接种96孔板，第2天加入不同浓度梯度的待测样本，培养24 h，CCK8检测药物对细胞的毒性作用。细胞死亡率在10%以下认为无细胞毒性。将待测样本无细胞毒剂量作为最高浓度稀释为系列浓度梯度，与效应细胞同时加入靶细胞共孵育24 h，Mar作为阳性对照药物，AZT为阴性对照药物。检测报告基因，计算融合抑制率。

融合抑制率(%) = (FC组蓝斑数-加药组蓝斑数) / (FC组蓝斑数-Mock组蓝斑数) ×100。

所有实验数据均为3次或以上重复实验结果，用GraphPad PRISM6.0绘图及进行统计学分析，P ＜ 0.05认为差异有统计学意义。

HIV-1 NL4.3质粒转染HEK-293T细胞，反转录PCR扩增tat片段，电泳图见图 2A。在250 bp附近有明显的扩增条带，tat片段为261 bp，与预期结果相符。构建真核表达克隆pEGFP-Tat，酶切鉴定，所得片段长度与预期结果相符(图 2B)。将pEGFP-Tat酶切结果正确的阳性克隆送上海生工进行测序，测序结果序列比对后完全正确。

将11035-Env和pEGFP-Tat两种质粒共转染HEK-293T细胞，Env质粒表达包膜蛋白，pEGFP-Tat质粒表达Tat蛋白和GFP荧光蛋白，GFP的亮度和表达率反映了蛋白表达量的多少，表达率越高，转染效率越高。将转染了质粒的HEK-293T效应细胞与TZM-bl细胞共培养以后，两种细胞两两融合或多个相互融合，形成大的合胞体或多核细胞，显微镜明场观察(图 3C)，多为巨型细胞，细胞边缘不整齐，模糊不清，颗粒增多，形态多样，呈叠层生长，荧光观察，有些细胞中呈现多个绿色荧光体，蓝斑染色发现有的细胞含有一个蓝斑，有的含有多个蓝色斑点。只转染了Tat蛋白的HEK-293T细胞与TZM-bl细胞共孵育后(图 3B)，显微镜明场下没有巨型细胞，只有单个的细胞，荧光观察，只能看到单个荧光的HEK-293T细胞，细胞蓝斑染色未见蓝色斑点。

不同量的Tat质粒和Env质粒共转染HEK-293T细胞。从图 4A、4B可知，当Tat质粒1 µg、Env质粒0.5 µg时，荧光强度最强，转染效率最高。共转染24、48、72 h显微镜下观察荧光强度，发现48 h比24 h强，与72 h无显著差异(结果未显示)，因此选取转染后48 h进行融合实验。

在TZM-bl细胞贴壁0、2、6、24 h时加入效应细胞，共孵育24 h后，进行蓝斑染色，发现随着贴壁时间延长，蓝斑数增多，24 h为最高(图 4C)。结果提示靶细胞贴壁时间对两种细胞的融合效果有显著影响，本系统选取贴壁24 h后进行细胞融合。

TZM-bl细胞10 000个/孔接种96孔板，24 h后加入不同量的HEK-293T效应细胞共培养，24 h后蓝斑计数(图 4D)。随着效应细胞的增多，融合的蓝斑细胞数增多，当每孔加到20 000个效应细胞，即HEK-293T与TZM-bl细胞为2:1时，蓝斑数最多，融合效率最高，随着效应细胞的增加，当二者比例为4:1时，融合效率下降，蓝斑数降低，因此选取效应细胞与靶细胞的数目分别为20 000和10 000作为最佳融合条件。

将已知不同靶点的上市药物Mar、AZT和Ral作用于该细胞融合系统。Mar为CCR5抑制剂，具有抑制细胞-细胞融合的作用，AZT为逆转录酶抑制剂，Ral为整合酶抑制剂，二者均没有融合抑制功能。由图 5可知，无论是蓝斑计数法还是荧光素酶法，Mar高剂量组测定值与融合对照组(FC)相比，有显著性差异(P ＜ 0.05)，说明其具有抑制融合的作用，而且结果还显示Mar与融合存在剂量效应关系。AZT和Ral组与FC组相比，无显著性差异(P ＞ 0.05)，没有融合抑制作用。实验结果与各药物抗病毒作用的靶点相符合，表明该方法筛选细胞融合抑制剂有良好的特异性。

用该系统测试了6种天然药物(包括提取物)及两种合成的化合物，本实验室前期研究发现这些样本在细胞水平具有一定的HIV-1抑制作用。细胞融合系统测定发现，有两种药物Myr和KH对融合有一定的抑制作用，高剂量组抑制率达到50%以上，半数抑制浓度为7.483 μg/mL和5.646 μg/mL，提示这两种药物可能通过抑制融合作用发挥抗病毒作用，其他几种药物的抗病毒作用与细胞融合无关(图 6A和6B)。

本研究利用Env蛋白介导细胞-细胞融合，Tat蛋白反式激活因子与LTR相互作用，调控报告基因的表达，建立了一个高效的细胞融合系统。我们构建了EGFP-Tat蛋白表达质粒，EGFP作为指示蛋白，评价效应细胞产生的效率。当两种细胞共培养时，效应细胞表面的gp120、gp41识别靶细胞的CD4、CCR5和/或CXCR4受体，发生细胞融合，Tat蛋白扩散到靶细胞，激活报告基因。影响上述过程中任一或多个蛋白活性，或者影响蛋白之间相互作用过程，都会导致报告基因的变化。因此该方法筛选的有抑制作用的样品，可能作用于某个融合靶点，也可能作用多个靶点，可广泛筛选具有切断细胞-细胞传播作用的药物。用Mar作为阳性药，AZT和Ral为阴性药，评价细胞融合系统筛选抑制剂的有效性。实验结果证实该系统可有效筛选融合抑制剂，特异性强，背景值低。蓝斑染色法和荧光素酶两种方法检测结果一致。

利用HEK-293T细胞作为效应细胞，该细胞株可以高效表达外源蛋白，表达率可达60%以上，保证了效应细胞的高效性。EGFP作为指示蛋白，通过荧光显微镜，可以实时快速反映转染蛋白表达情况和细胞融合情况，流式细胞仪检测还可以确定表达了Tat、Env蛋白效应细胞的比例，不同于De-Chun Cheng等[14, 21]建立的系统，只有进行到细胞融合的终点才能评价此次实验融合情况。

Tat调控蛋白只有通过融合作用才能进入靶细胞调控报告基因的表达，非特异性低。该方法有荧光素酶和β-半乳糖苷酶双报告基因系统，均可反映样本对融合的抑制情况。用荧光素酶试剂盒测定，灵敏度高，时间短，出结果快；基于β-半乳糖苷酶特性进行的细胞蓝斑染色，背景值低，特异性强，检测成本低。两种指标同时检测，可排除样本对某种报告蛋白直接影响带来的假阳性，提高检测的特异性。但对报告蛋白直接影响的样本很少，因此通常只采取一种检测方法即可。用不同的HIV包膜蛋白质粒与Tat质粒进行转染，可以建立不同HIV包膜的细胞-细胞融合系统，筛选针对某一HIV亚型的细胞融合抑制剂，优于用表达Env、Tat的细胞系作为效应细胞的筛选方法[26-27]。但同时这也成为该方法不足之处，效应细胞蛋白瞬时表达，增加筛选的时间和系统的变异性。但由于HEK-293T细胞转染效率高，经多次重复实验，转染率差异在3%以内，对融合效果检测影响不显著。

用该系统筛选了8个样本，Mar为融合阳性药物对照，AZT为融合阴性药物对照。首先用CCk8方法检测药物的细胞毒性，用药物的无毒剂量进行融合筛选实验，排除药物的细胞毒性对融合的影响，发现天然化合物Myr和化学合成物质KH具有显著抑制融合作用，最高剂量的抑制率在50%以上，IC50分别为7.483 μg/mL和5.646 μg/mL，为筛选具有融合作用的药物提供了有效的方法。