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逆转路病毒分离-慢病毒
简单和复杂的逆转录病毒都含有两份线性、不分节段的、长7-12 kb的单链RNA，编码gag, pol和env基因。
Gag编码一种多聚蛋白，翻译自一条无拼接的mRNA，mRNA然后被病毒蛋白酶（PR）切割成MA、CA和NC蛋白。
Pol表达的是Gag-Pol多聚蛋白，编码RT、PR和IN三种酶。这三种蛋白附着在病毒粒子的基因组上。RT蛋白拥有如下三种活性：（a） RNA依赖的DNA聚合酶活性，负责将两条RNA转录成一个cDNA；（b） 核糖核酸酶H活性；（c） DNA依赖的DNA聚合酶活性。PR用于切割Gag和Gag-Pol多聚蛋白，导致病毒粒子的成熟和产生具感染能力的病毒粒子。IN负责将病毒的cDNA整合至宿主细胞基因组中。一旦整合完毕，病毒基因组便与宿主细胞染色体相连，称为前病毒
Env基因也编码一种多聚蛋白前体，前体被细胞内的蛋白酶切割成表面包膜糖蛋白（SU）gp120和跨膜（TM）糖蛋白gp41。其中，gp120与细胞表面受体和辅助受体相互作用，gp41在病毒膜上与gp120形成gp120／gp41复合体，在病毒进入宿主细胞时催化膜融合。
复杂的逆转录病毒基因组区别于简单的逆转录病毒基因组的地方主要在于前者存在一套附属基因，其产物涉及到转录调控、RNA转运、基因表达与装配。其中包括Rev和Tat蛋白以及Vpu、Vif、Vpr和Nef这些附属蛋白。Rev是一种RNA结合蛋白，保证晚期基因的表达。它还对未拼接的和单股拼接的mRNA的转运来讲非常重要，它编码从核到细胞质的病毒结构蛋白。Tat是一种RNA结合蛋白，起到增强转录的作用。Nef蛋白抑制T细胞激活。Vpu能增强病毒进入过程中从细胞表面到细胞质中的释放。Vif蛋白是慢病毒复制所必须的，因为它能下调宿主的抗病毒反应
慢病毒载体来源于人类免疫缺陷病毒HIV，属于逆转录病毒家族。野生型慢病毒的5'LTR可以驱动病毒基因组的转录，3'LTR能够终止上游转录。但LTR可转移到细胞原癌基因邻近处，使正常细胞转化为癌细胞。因此，在慢病毒载体中需要删除5'LTR的部分序列，提高慢病毒载体的安全性。此外，通过删除与病毒包装和转导相关的基因形成复制缺陷型的慢病毒颗粒，限制其在靶细胞中的大量复制，提高生物安全性。
图 1. 简单和复杂逆转录病毒粒子结构。病毒颗粒含有两份正链RNA，RNA上附有反转录酶（RT），它们位于病毒的内核。除此之外，内核还包含核壳（NC）、衣壳（CA）、整合酶（IN）和蛋白酶（PR）。内核由一圈基质蛋白（MA）所包围，基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白（ENV）的腹膜所包围。
! 图 3. 逆转录病毒的复制。感染始于病毒的Env蛋白与细胞表面受体相互作用，然后进入细胞。RNA基因组由RT反转录为双链DNA，然后入核，在IN的作用下整合至宿主基因组内。新合成的病毒蛋白和病毒基因组RNA积累一段时间后，这些组成部分被包装成一个个病毒颗粒，以出芽的方式离开细胞，获得了一层来源于细胞的膜。当Gag和Gag-Pol多聚蛋白被病毒蛋白酶切割后，病毒颗粒成熟。 图 5. 慢病毒质粒。很多的慢病毒系统使用一个转运质粒和两个辅助质粒。它们的特征在文中已有详尽的描述。更新的系统也许会使用三个辅助质粒，其中rev基因编码在一个单独的质粒上。通过进一步阻止重组事件的发生，阻止能自我复制的病毒的产生，这被认为能改进安全性。在程序上，慢病毒和逆转录病毒载体的一个重要区别在于：对慢病毒载体，通常包装、包膜和转运质粒共转染入包装细胞系，而对逆转录病毒载体，只有转运载体才转染到细胞系内，而细胞系早已稳定表达另外两种载体. 选择转运质粒时，需要关注驱动目标基因的启动子。RNA聚合酶II启动子（如CMV）驱动编码蛋白质的RNA的表达。RNA聚合酶III启动子（如H1或U6）驱动更短的转录本的表达，如shRNA。包膜蛋白 病毒载体可以借助其他病原体的外壳蛋白包装成假病毒，以改变其嗜性。最常用的是疱疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G） 。其他常见的包膜蛋白来源于狂犬病毒、鼠白血病病毒、埃博拉病毒、杆状病毒、麻疹病毒和纤丝病毒。杆状病毒GP64和肝炎E1和E2型假病毒增强肝转导，纤丝病毒包膜型假病毒增强呼吸道上皮细胞或内皮细胞的转导。有趣的是，假病毒还会影响狂犬病毒糖蛋白包被的慢病毒的运输，导致轴突逆行运输 [12] 。 pCMV-VSV-G含有在CMV启动子驱动下表达疱疹性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)的基因序列，这个基因用于代替原病毒中编码病毒包膜蛋白的基因，可以大幅提高病毒的宿主细胞范围。注意：由于γ-逆转录病毒和慢病毒gag、pol和env基因间的亚型差异，转运质粒和包装质粒不能够互换。 该系统中还增加了两个元件，分别为来源于旱獭肝炎病毒的转录后调控元件（Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulation element, WPRE）和来源于HIV1整合酶基因的central Polypurine Tract（cPPT），WPRE有利于增加蛋白的表达量，而cPPT元件则有利于增加病毒的滴度，WPRE和cPPT元件能使蛋白的表达量至少提高4倍。 慢病毒颗粒的生产和转导 慢病毒包装载体 助转染试剂：（Ploybrene的选择）Ploybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene感染效率可以提高2-10倍。Polybrene有一定的细毒性，有的细胞对polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1-10ug/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞武鸣县毒性反应为最佳，可参考文献并进行预实验摸索，polybrene最常用的工作浓度6-8ug/ml。 第二代包装系统 这个系统含有3个质粒，第1个质粒：包装质粒，它编码Gag，PoI，Rev与Tat基因。第2个质粒：包膜质粒，含有VSV-G，编码蛋白Env。第3个质粒：目的质粒，含有病毒的LTRs和psi包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个目的质粒的目的基因是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件 的来激活它。所有的第2代慢病毒目的质粒必须要用第2代慢病毒包装系统，因此它的LTR是Tat依赖性的。 第三代包装系统： 设计第3代病毒的目的主要还是提高安全性。在第3代病毒中，将第2代病毒的包装质粒分成了2个质粒，一个编码Rev，另外一个编码Gag和PoI。虽然第3代病毒更加安全了，但是它的效率却降低了。除此之外，第3代病毒删除了Tat元件，并且在目的质粒中引入了一个嵌合了5'LTR的异源启动子。这种目的质粒基因的启动子并不依赖于Tat元件。第3代病毒的目的质粒可以使用第2代或第3代的包装质粒，也就是说第3代慢病毒的目的质粒兼容第2代的包装系统。参考：https://www.addgene.org/viral-vectors/lentivirus/lenti-guide/ |
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