TAK1 Rabbit mAb |
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| 产品内部验证反应物种Human, Mouse同种型IgG克隆号ARC0413产品应用测试种属及综合评分WBHuman:
Mouse:
推荐稀释比WB1:500 - 1:2000IP1:500 - 1:1000理论分子量53kDa/56kDa/64kDa/67kDa实际分子量75kDa产品形式Liquid存储缓冲液Store at -20℃. Avoid freeze / thaw cycles.Buffer: PBS with 0.02% sodium azide,0.05% BSA,50% glycerol,pH7.3.偶联物Unconjugated阳性样本293T,HeLa,A-549,NIH/3T3,Mouse brain细胞定位Cell membrane,Cytoplasm,Cytoplasmic side,Peripheral membrane protein纯化方式Affinity purificationMAP3K7 相关产品查看更多相关产品 >抗体（5）抗原信息免疫原A synthetic peptide corresponding to a sequence within amino acids 507-606 of human TAK1 (O43318).序列LQPLAPCPNSKESMAVFEQHCKMAQEYMKVQTEIALLLQRKQELVAELDQDEKDQQNTSRLVQEHKKLLDENKSLSTYYQQCKKQLEVIRSQQQKRQGTS进行序列比对实验步骤折叠内容 >实验步骤
蛋白质印迹法标准操作流程
一、实验试剂及耗材 1、样品制备试剂 a. RIPA 裂解液 b. 蛋白酶抑制剂 c. BCA工作液 d. BSA Standard Solution(5mg/ml)（RM00005） e. 1×PBS缓冲液（RM00012） f. 5×loading buffer（RM00001） 2、制胶试剂 a．30% Acr-Bis (29:1)（RM00006） b．1 M Tris-HCl (pH6.8)（RM00003） C．1.5M Tris-HCl (pH8.8)（RM00002） d．10%SDS（RM00004） e．10%Ammonium persulfate (APS)（RM00007） f．TEMED（RM00009） 3、电泳、转膜试剂及耗材 a. 1X Tris-Glycine SDS Running Buffer（RM00010） b. 1X Western Transfer Buffer（RM00011） c. Filter Paper (7.5×10cm)（RM00019） d. Nitrocellulose membrane（RM00017/ RM02801/ RM00018） 4、封闭、一抗二抗孵育及曝光试剂 a. 1XTBST Buffer（RM00013） b. 1X Western Blocking Buffer（RK05742） c. Skimmed milk powder（RM00014） d. Bovine Serum Albumin (BSA)（RM02802） e. Western Antibody Dilution Buffer（RK05743） f. HRP 偶联二抗（AS014/AS003） g. SignalFire™ ECL Reagent（RM00020/RM00021）二、实验步骤 1、样品制备（1）细胞收集 a. 贴壁培养细胞收集 去除贴壁细胞的培养液，用PBS、NS或无血清培养基清洗1次，低速离心，弃上清，留取沉淀。 b. 悬浮培养细胞收集 速离心悬浮细胞，弃上清，收集沉淀。手指轻弹细胞，使其松散。 c. 组织样本收集 把组织剪切成细小的碎片，越小越好。取液氮或超低温冰箱中冷冻30min以上的组织，迅速用液氮研磨，研磨过程尽量控制在1~2min之内，以减少蛋白的降解。（2）总蛋白提取 a. 细胞/组织裂解 将装有细胞沉淀或组织碎片的容器完全插入冰中。细胞沉淀按照1mL裂解液/107个细胞(1个T75培养瓶细胞量)的比例加入相应体积的裂解液（细胞量足够时都加入3mL，不足时根据细胞量计算），裂解20min，每隔5min将离心管置于涡旋振荡仪上震荡10s。组织碎片按照0.5mL 裂解液/100mg组织向匀浆器中加入蛋白裂解液，每3min研磨一次，重复5次，使组织尽量碾碎。（裂解液中根据需要选择添加或不添加蛋白酶抑制剂）。 b. 离心 把裂解好的样品配平后，置于预冷的高速冷冻离心机中，12000 rpm，15min。 c. 蛋白变性 完成离心后，上清即为蛋白提取液。吸取少量蛋白提取液做蛋白浓度测定。向剩余的蛋白提取液的离心管中加入1/4上清体积的5×Loading Buffer（最终工作液为1X)，待干式恒温器温度升至95℃后，将1.5mL离心管插入加热孔中，95℃加热变性10min，待液体完全冷却后置于-20℃保存。（3）蛋白浓度测定（BCA法） a. BCA工作液的配置 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。 b. 标准品测定 取10μl蛋白标准品（5mg/ml BSA）稀释至50μl，使终浓度为1mg/ml。稀释后的蛋白标准品可以-20℃长期保存。此标准品溶液的稀释液可使用去离子水或1*PBS。将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μl加入到96孔板中，加稀释液补足到20μl（见附表）。加适当体积样品到96孔板的样品孔中，如果样本不足20μl，需加稀释液补足到20μl。请注意记录样品体积。各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置20-30min。用酶标仪测定A562，或540-595nm之间的其他波长吸光度。根据标准曲线和使用的样品体积计算出样品的蛋白浓度。 2、凝胶电泳（1）制胶器安装 根据使用说明书安装。（2）分离胶制备 根据不同蛋白大小，选择不同浓度的分离胶（见附件表）。将制备好的胶溶液注入预先安装好的制胶器中，加入异丙醇封胶。室温水平放置30min左右。注意防止胶溶液产生气泡并注入制胶器中；注胶前再加入TEMED，防止注胶前凝固；注入异丙醇时需沿玻板一边缓慢拖动加入。（3）浓缩胶制备 分离胶凝固后，沿玻板一边倒出异丙醇，并用滤纸吸干。再根据需要的体积制备浓缩胶（见附表）。将制备好的胶溶液注入制胶器中，并把准备好的样品梳沿玻板一端缓慢插入胶溶液中，室温水平放置20-30min。注意样品梳与胶溶液之间避免气泡产生。（4）上样 待浓缩胶凝固好后，双手垂直拔出样品梳，并用Tris-Glycine SDS Running Buffer注入到内外槽中，形成闭合回路。用移液器吸取样品垂直梳孔上样，蛋白含量25ug/孔。注意内槽Tris-Glycine SDS Running Buffer需注满，外槽Tris-Glycine SDS Running Buffer没过底部3~5cm即可。（5）电泳 上样完以后，连通电泳仪电源，注意正负极需连接正确，设定适宜的电泳参数，浓缩胶电泳参数为恒压80V，待样本进入分离胶时，可将电泳调至120V。当溴酚蓝电泳到凝胶底部时，停止电泳，关闭电泳仪电源。 3、转膜（1）准备工作 a. 转膜缓冲液至少提前2h （即开始电泳后）放入-20℃冰箱预冷。 b. 根据胶体大小选择,将Filter Paper及Nitrocellulose membrane剪裁至合适尺寸。 c. 目的蛋白＞20KD选择0.45μm NC膜；目的蛋白＜20KD选择0.2μm的NC膜或0.22μm的PVDF膜，选择完毕后将NC膜放在Western Transfer Buffer中浸泡备用，注意如使用的是PVDF膜需先放入甲醇中浸泡5-10min，再放入Western Transfer Buffer中浸泡备用。（2）转膜 取出玻板中的凝胶，在夹板上依次放一块多孔垫、三张滤纸、凝胶、NC膜、三张滤纸、一块多孔垫（“三明治”结构），将转好的膜放在转膜槽，按一定的条件进行转膜。（见附表） 4、封闭 将膜从“三明治”结构中取出，放入合适的抗体孵育槽中，加入Western Blocking Buffer室温孵育1h，一张6.3×8.3cm大小的膜加入6~7ml即可。 5、一抗孵育 a. 将一抗用Western Antibody Dilution Buffer按照合适比例进行稀释。 b. 封闭结束后，将稀释好的一抗工作液倒入孵育槽中，室温2h或4℃过夜。 6、洗涤 一抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。 7、二抗孵育 a. 一抗洗涤结束前10min，将二抗用1XTBST Buffer按照合适比例进行稀释。 b. 洗涤结束后，将稀释好的二抗工作液加入孵育槽中，室温1h。 8、洗涤 二抗孵育结束后，加入TBST Buffer洗涤4次，5min/次。 9、曝光 a. 根据膜的大小，按每 10cm2 膜使用 1-2ml 工作液，按比例吸取等体积的 SolutionⅠ和 SolutionⅡ混匀，配制成发光检测工作液。 b. 用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均有覆盖，室温孵育 1-2min，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。 c. 压片检测：将膜固定于片夹内。暗室内压片 1 分钟，立即显影定影，根据结果再调整压片时间。或直接分别压片 30 秒、1、3、 5 分钟，然后一起显影定影观察结果。 d. 荧光成像仪检测：将膜放置到荧光成像仪内，参考仪器说明书进行检测。附表1：BSA标准品稀释 1mg/ml BSA(μl) 稀释液(μl) 对应的蛋白含量（mg/ml） 0 20 0 1 19 0.05 2 18 0.1 4 16 0.2 8 12 0.4 12 8 0.6 16 4 0.8 20 0 1附表2：分离胶浓度的选择 分子量（kDa) 分离胶浓度 X≤10 15% 10 |
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