导语

中性粒细胞形成称为中性粒细胞胞外陷阱 (NETs) 的细胞外网状结构。新出现的证据表明，癌症可以诱导 NET 的形成；然而，尚未完全了解 NETs 如何影响癌症生物学，并且尚未就其促癌或抗癌作用达成共识。

背景介绍

今天小编为大家带来的这篇文章，探索和讨论了 NET 富集、NET 相关基因调控模式，以及 NET 对 22 种主要人类癌症类型的大约 8,000 名患者的预后影响。文章发表在《Frontiers in Immunology》上，影响因子为8.786，文章题目为：Pan-Cancer Analysis Reveals a Distinct Neutrophil Extracellular Trap-Associated Regulatory Pattern。

数据介绍

本研究从 TCGA 数据门户网站下载了 22 种人类癌症类型的大约 10,000 名患者的 FPKM 标准化 mRNA 表达谱和临床特征。去除批次效应后，从 UCSC Xena 下载包含大约 10,000 个样本的 PanCan TCGA 表达集。BRCA 蛋白表达谱是从 CPTAC下载的。从登录号为 GSE78220 和 GSE91061 的 GEO 数据集下载 2 个膀胱癌样本和 1 个皮肤癌样本的基因表达阵列。

技术路线

本研究技术路线如图所示。

结果解析

01、泛癌NET相关失调的定义  

为了对不同癌症类型的 NET 进行概述 ，本研究定义了 22 种癌症中 23 个基因的泛癌 NET 特征。为了量化浸润的 NET，本研究计算了每种癌症类型的 NET 签名（NET 分数）的 GSVA 富集分数。不同肿瘤类型的 NET 评分差异很大（图 1A），头颈癌 (HNSC) 和两种类型的肺癌（LUAD、LUSC）成为 NET 富集的前三种癌症类型。

接下来本研究比较了 PANCAN 数据集中肿瘤和副肿瘤组织与个体癌症类型之间 NETs 相关基因的表达水平，并发现了不同癌症类型和基因的失调模式。其中 CAT、CTSG、LTF、LCP1、S100A8 和 S100A9 失调最严重；LUSC、LUAD、GBM、ESCA、CHOL 和 CESC 显示出失调的 NET 基因的最高积累（图 1B）。此外，火山图显示大多数 NET 相关基因在泛癌分析中上调（图 1C）。

图 1

NET 形成是一个复杂的调节过程，涉及一系列生物学步骤和遗传相互作用；因此，本研究决定研究 NET 基因的相互作用模式。为此，本研究在 STING 数据库中检查了 NET 基因的潜在蛋白质-蛋白质相互作用网络 (PPI)，并发现了一个复杂的相互作用网络，表明由 NET 形成的共同调节网络（图 1D）。总之，这些结果揭示了各种癌症类型中 NET 形成的失调模式。

02、NET分数与主要癌症标志密切相关，尤其是炎症反应  

本研究进一步探讨了 NET 评分与几个关键癌症标志之间的关系，包括血管生成、抗细胞凋亡、非整倍体、上皮间充质转化 (EMT)、糖酵解、缺氧、炎症反应和细胞增殖。 本研究比较了 NET 和标志分数之间的 Pearson 相关性，这些分数由基因集的 ssGSEA 分数表示。八个标志中有六个与 NET 分数呈正相关。在这一组中，炎症反应显示出最高的相关性，在 22 种癌症类型中，有 14 种的 R 值超过 0.6。相比之下，增殖和非整倍体与 20 种癌症类型的 NET 评分呈负相关（图 2A）。使用 MCPcounters，本研究对 10 种免疫和基质细胞成分进行了反卷积，发现 NET 评分与大多数癌症类型中的单核细胞、中性粒细胞和髓样树突状细胞之间存在正相关；然而，本研究发现 NET 评分与细胞毒性 T 细胞、NK 细胞或 B 细胞之间没有显著关联（图 2A）。

本研究还比较了每种癌症类型的 NET-high 和 NET-low 组之间几种类型免疫细胞的趋化因子谱。 火山图显示，NET-high 组趋化因子的表达水平普遍较高，并且在所有癌症类型中对粒细胞和白细胞的趋化作用可能更强，表明 NETs 与癌症免疫细胞之间存在复杂的调节网络（图2B )。

图 2

然后，本研究在接受抗 PD1 治疗的 3 个独立队列中比较了反应组（PR、CR）和无反应组（SD、PD）之间的 NET 评分 。与 NET 评分和免疫检查点基因之间的相关性一致，3 个队列中有 2 个的无反应组的 NET 评分显著更高（图 2C）。这些发现强调 NETs 作为关键癌症相关生物过程和肿瘤相关免疫学的中央调节器，并表明 NETs 可能预测免疫检查点抑制结果。

03、NET对不同癌症类型具有不同的预后影响  

为了研究 NET 评分对癌症预后的影响，本研究分析了来自 22 种不同癌症类型的 8,059 名患者的数据。 这些患者根据 NET 评分分为 4 类，并通过 Kaplan-Meier 分析比较他们的生存率。NET 评分最高分位数的癌症患者预后最好，而最低分位数的患者预后最差（图 3A）。由于所选癌症类型包含非常不同类型的恶性肿瘤，因此本研究随后分别评估了每种癌症类型的 NET 相关生存率。在前列腺癌 (PAAD)、食道癌 (ESCA)、皮肤癌 (SKCM)、肉瘤 (SARC)、乳腺癌 (BRCA) 和结肠癌 (COAD) 中，较高的 NET 评分与有利的生存相关。相比之下，在胰腺癌 (PDAC)、肺鳞癌 (LUSC)、胶质母细胞瘤 (GBM)、低级别胶质瘤 (LGG)、卵巢癌 (OV)、胃癌 (STAD) 和膀胱癌 (BLCA) 中，更高NET 分数与较差的生存率相关（图 3B）。这些结果表明在不同的癌症类型中存在两种 NET 相关的生存模式。

图 3

04、确定存活率高或低的癌症中NET相关的调节模式  

为了解释不同癌症类型的不同 NET 相关结果，本研究定义了与每种癌症类型的 NET 评分密切相关的 NET 相关基因 (NRG) 组。总共确定了 35,034 个 NET-NRG 对，其中 15,476 个属于 NET 相关生存率较高的癌症，19,558 个属于 NET 相关生存率较差的癌症（图 4A）。在每个生存组中超过 5 种癌症类型中鉴定出的 NET-NRG 对被进一步定义为核心 NET-NRG 对，NET相关生存良好的癌症类型中有533对NET-NRG对，NET生存较差的癌症类型中有709对NET-NRG对，其中411 对重叠（图 4B）。

为了进一步探索 NRG 失调，本研究重新检查了 HepG2 和 MHCC97H 癌细胞的 RNA 数据在-之前的研究中有没有 NET 刺激。该分析表明，在 NET 刺激后，具有良好或不良存活率的 NRG 以及所有 NRG 都被上调（图 4C、D）。

图 4

两组 NET-NRG 对具有不同的生物学功能。两组 NET-NRG 对的 KEGG 注释表明，具有良好 NET 相关生存率的癌症类型中的 NET-NRG 对富集在Rap1、鞘脂信号和松弛素信号通路。对于 NET-NRG 对，在 NET 相关生存率较差的癌症中，富集在局灶性粘连和 ECM-受体相互作用。对于共享的 NET-NRG 对，富集在细胞因子相关通路和金黄色葡萄球菌感染（图 4E-G）。这些模式可能对 NET 相关的生存产生至关重要的影响。

05、NET相关的调控模式与预后相关的共表达基因簇有关  

本研究假设 NET 相关基因包括 2 组：具有促肿瘤作用的基因和具有抗肿瘤作用的基因。 为了探索这种可能性，本研究评估了 NRG 在各种癌症类型中的个体表达偏倚，并确定了 NET 评分的总体预后影响。本研究使用单变量 Cox 模型计算了 NRG 的风险比 (HR)，并将 NRG 的平均值作为截止值。本研究绘制了 NRG 的 HR 分布，并将 NRG 分配给泛癌背景下预后不良或良好的预后标志物组。

结果发现NET 相关生存率较差的癌症类型中的 NET 相关调控基因往往具有风险决定性，例如 LGG 和 GBM（图 5A、B）。在 298 个与生存率低的癌症类型相关的 NRG 中，559 和 562 个模型符合 HR >1 或 0.4 的 NRG（图 6A）。本研究比较了两个癌症组之间的基因表达水平，并定义了一组与 NET 普遍相关的基因，其中 SPP1 在 NET 相关生存率较差的癌症中高表达（图 6B）。 SPP1 和 NET 评分之间的 Pearson R 值表明，SPP1 仅在 NET 相关生存率较差的癌症类型中与 NET 评分呈正相关，在具有良好 NET 相关生存率的癌症类型中，未发现相关性（图 6C）。本研究使用单因素 Cox 模型进一步探讨了基因和 NET 评分对患者结果的综合影响。结果发现不同亚组之间存在显著的生存差异，其中 SPP1/NETs 高患者中预后较差（图 6D）。本研究发现 SPP1 在 NET 相关生存率较差的癌症类型中高表达并与 NET 评分相关。

图 6

07、SPP1与NETs潜在的协同促肿瘤作用  

基于 NET 评分和 SPP1 表达水平之间密切相关的促肿瘤网络的数据挖掘，本研究进一步研究了它们对癌症行为发挥协同作用的潜力。本研究比较每种癌症类型中NETs/ SPP1 高组和低组的EMT评分。结果显示几乎所有癌症类型在 NETs/SPP1-high 组中都显示出显著更高的 EMT 分数（图 7A）。

在进一步的实验验证中，本研究通过 siRNA 敲低了 MHCC97H 肝癌细胞中的 SPP1 表达（图 7B、C），然后应用NET刺激。在肝癌中，NETs在Transwell试验中促进MHCC97H细胞的侵袭；然而，SPP1 敲低消除了 NET 的入侵促进作用(图7D, E)。在体外系统中，本研究探索了SPP1编码蛋白OPN如何影响中性粒细胞，发现SPP1 (OPN)促进中性粒细胞趋化，OPN直接刺激NET的形成(图7F)。SPP1编码分泌因子骨桥蛋白(OPN)，具有广泛的免疫相关调节功能，尤其是髓系细胞。

图 7

由于本研究的数据挖掘揭示了NET得分与SPP1表达之间的紧密联系，本研究假设SPP1也可能对NET具有调节作用。本研究在具有 Hepa1-6 肝癌细胞和过表达 SPP1 (Hepa1-6spp1) 的 Hepa1-6 肝癌细胞的免疫活性小鼠中使用原位模型。结果发现携带 Hepa1–6spp1 的小鼠在肝脏肿瘤中增加了 NET 形成，如两个 NET 标记 MPO 和 H3cit 表达所揭示的那样（图 7G、H）。这些结果表明 SPP1 (OPN) 和 NETs 在促进癌细胞转移方面可能存在合作。

小编总结

通过综合分析，本研究现在为 NETs 在癌症中的失调作用提供了一个新的全面视角。 本研究发现，除了 NETs 在促进恶性肿瘤方面的明确作用外，还有与 NET 相关的抗肿瘤反应。这种抗肿瘤发生反应的鉴定可能支持开发利用 NET 抗癌作用的新治疗策略。此外，本研究还提供了关于 NETs 如何与其他癌症标志、癌症预后和几个基因集相关联的新见解。在这些新联系中，NET 诱导的炎症反应以及 NETs 对免疫细胞趋化性和趋化因子调节的影响值得进一步研究。

本研究的缺点主要在于分析的标记数量。 由于实验限制，大多数研究仅分析两个或三个 NET 相关蛋白作为 NET 标记，例如 MPO 或 DNA 水平。也许这种狭隘的观点不足以提供更全面的的视角。

总之，本研究的研究结果表明，NET 在癌症中很常见，但在不同的癌症类型中显示出不同的调节模式。而 SPP1 可能是与 NET 相关的不良结果的关键。