作者 | 戴迟迟 编辑 | 戴迟迟 校对 | 李仲深

今天给大家介绍美国加利福尼亚大学Jingyi Jessica Li教授等人发表在Nature Communications上的一篇文章 “An accurate and robust imputation method scImpute for single-cell RNA-seq data” 。新兴的单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 技术能够在单细胞水平研究转录组学情况。但是ScRNA-seq数据分析由于过多的零计数而变得复杂，也就是所谓的“dropout”事件，这是由于单个细胞内测序的mRNA量过少。 本文提出了scImpute，一种统计方法，可以准确而可靠地估算出scRNA-seq数据中的“dropout”。 scImpute自动识别可能的“dropout”，并且仅对这些值执行插补，而不会对其余数据引入新的偏差。scImpute还可以检测离群细胞并将其排除在插补之外。根据在模拟的和真实的人类和小鼠scRNA-seq数据中进行评估，表明scImpute是一种有效的工具，可识别可能的“dropout”，增强细胞亚群的聚集，提高差异表达分析的准确性，并有助于基因表达动力学的研究。

一、研究背景

批量细胞RNA测序 (bulk RNA-seq) 技术已广泛用于转录组分析，以研究转录结构，剪接模式以及基因和转录本表达水平。但是，重要的是要考虑特定于细胞的转录组格局，以解决生物学问题，在批量RNA序列中，无法解决细胞异质性，因为可变表达基因的信号将在整个细胞中被平均。幸运的是，单细胞RNA测序 (scRNA-seq) 技术现在正在成为捕获整个转录组细胞间变异性的强大工具。 scRNA-seq数据的一个重要特征是“dropout”现象，即在一个细胞中以中等表达水平观察到一个基因，而在另一细胞中未检测到该基因。通常，这是由于单个细胞中的mRNA含量低而发生的，因此在某些细胞中进行测序时可能无法检测到真正表达的转录本。

本文为scRNA-seq数据提出了一种新的插补方法scImpute，以同时确定哪些值受数据中的“dropout”事件影响，并且仅对“dropout”条目执行插补。为了实现这一目标，scImpute首先根据混合模型学习每个基因在每个细胞中的“dropout”概率。接下来，scImpute通过借用其他相似细胞中相同基因的信息来插补细胞中的“dropout”值 (图1)。

二、模型与方法

对于每个细胞类别k中的基因i，其表达值与一个随机变量

有关：

其中

是基因i在细胞类别k中的“dropout”率，

，

为Gamma分布的参数，

，

是Normal分布的参数。随后使用期望最大化来估算上述参数，其估计值被定义为

和

。因此，细胞j中的基因i的“dropout”概率

为：

在插补过程中，对于每个细胞j，本文将所有基因划分为两组：

代表需要插补的基因；

代表有精确表达的基因，其中t为阈值。插补过程就是使用B中的基因插补A中的基因：

图1. scImpute的插补流程

三、实验结果

3.1 scImpute恢复受“dropout”影响的基因表达

本实验使用三个示例来说明scImpute在插补基因表达中的功效。

第一，本实验证明scImpute恢复了ERCC spike-in转录本的真实表达，特别是受“dropout”事件影响的低丰度转录本。ERCC钉蛋白是具有已知浓度的合成RNA分子，可作为真实表达水平的标准，因此可以将插补的表达值读数计数与其进行比较，以进行准确性评估。数据集包含来自小鼠体感皮层区域的3005个细胞。插补后，这57个转录本的读数计数与其真实浓度之间的中等相关性从0.92增加到0.95，最小相关性从0.81增加到0.89。读数计数和真实浓度在每个细胞中也表现出更强的线性关系 (图2)。

图2. scImpute可改善ERCC RNA转录本的“dropout”

其次，本实验证明scImpute正确插补了已分为三个细胞周期阶段 (G1，G2M和S) 的182个胚胎干细胞 (ESC) 中的892个带注释的细胞周期基因的“dropout”值。已知这些基因调节细胞周期，并预期在细胞周期的不同阶段具有非零表达。插补之前，细胞周期基因原始计数的22.5％为零，这很可能是由于“dropout”造成的。插补后，校正了大部分的“dropout”值，并揭示了这些基因在细胞周期中的真实动态。插补后的计数也更好地代表了这些细胞周期基因的真实生物学变异 (图3)。

图3. 9个细胞周期基因表达值计数的小提琴图

最后，本实验使用模拟研究来说明scImpute在增强细胞类型识别中的功效。实验模拟了三种细胞类型c1，c2和c3的表达数据，每种类别具有50个细胞，而20,000个基因中的810个真正地被差异表达 (DE)。尽管当将主成分分析 (PCA)应用于完整数据时，这三种单细胞类型可以清晰地被区分，但它们在原始数据中的分离度会有所下降，并伴有“dropout”事件。基于前两个主成分 (PC) 计算的群集内平方和从完整数据中的94增加到原始数据中的2646。但是，在应用scImpute之后，阐明了150个细胞之间的关系。MAGIC和SAVER这两种方法也能够区分这三种细胞类型，但是MAGIC引入了人工信号，这些信号大大改变了数据，从而改变了PCA结果，而SAVER仅比原始数据稍微改善了聚类结果 (图4)。另外，“dropout”事件掩盖了差异模式，因此增加了检测DE基因的难度。scImpute插补后的数据导致不同细胞类型的上调基因之间的对比更加清晰，而MAGIC和SAVER插补后的数据无法恢复这种模式 (图4)。实验还评估了“dropout”率的普遍性如何影响scImpute的性能。不出所料，随着“dropout”率的降低，基于插补后数据的DE分析的准确性得到了提高。

图4. scImpute校正“dropout”值并帮助定义模拟数据中细胞的身份

3.2 scImpute改进了对细胞亚群的鉴定

为了证明scImpute协助识别细胞亚群的能力，本实验将scImpute应用于两个真实的scRNA-seq数据集。第一个是小鼠植入前胚胎的较小数据集。它包含来自10个发育阶段的268个scRNA-seq图谱。部分由于“dropout”事件的缘故，原始计数矩阵中70.0％的读取计数为零。为了说明这种缺失现象，本文在补充材料中绘制了两个16-细胞阶段细胞的读取计数的log读数。即使这两个细胞来自同一阶段，许多表达的基因中只有一个计数为零。通过scImpute插补的数据可以缓解此问题，并且两个细胞之间的Pearson相关性从0.72增加到0.82。

本实验通过研究前两个PC的聚类精度来比较插补结果。尽管有可能将主要的开发阶段与原始数据区分开，但是通过scImpute插补得出的插补数据会输出更紧凑的簇 (图5)。MAGIC给出了清晰的发育阶段模式，但是由于许多处于同一阶段的细胞前两个PC中的得分几乎相同，因此具有丢失生物学上有意义的变异的高风险。scImpute是唯一能够检测离群细胞的方法。然后，实验还在前两个PC上比较频谱聚类算法的聚类结果。由于真正的簇标签包括胚胎发育中的几个子阶段，因此使用不同数量的簇，k = 6、8、10、12和14。通过四种不同的方法对结果进行评估：调整后的Rand指数 (ARI)，Jaccard指数，标准化互信息 (NMI) 和纯度。所有这四个量度都表明，与不进行插补，通过MAGIC或SAVER进行插补相比，scImpute得到最佳的聚类结果。该结果表明，scImpute通过在scRNA-seq数据中插补“dropout”值来改善细胞亚群的聚集。

图5. scImpute改善了小鼠胚胎细胞中的细胞亚群

本实验还将scImpute应用于基于高通量液滴系统生成的大型数据集。数据集包含9种免疫细胞类型的4500种外周血单核细胞 (PBMC)，每种类型有500个细胞。在原始数据中，92.6％的读取计数为零。如果通过t-SNE降维，则细胞毒性和初始的细胞毒性T细胞会聚在一起，而其他四种类型的T细胞不会分开。经过scImpute的插补后，将细胞毒性 (标记11) 和初始细胞毒性T细胞 (标记8) 分为两组，现在可以将初始T细胞 (标记5) 和记忆T细胞 (标记3) 与其余的T细胞区分开来 (图6)。该证据显示，尽管缺少细胞类型信息，scImpute仍具有很强的识别细胞亚群的能力。另一方面，MAGIC不能改善相同类型的细胞聚类，并且SAVER运行时间过长。经scImpute插补后，单核细胞被分为一个大簇和两个小簇，实验发现这三个簇揭示了两个典型基因的动力学：FCER1A在单核细胞分化为树突状细胞的过程中积累，S100A8的表达在人类单核细胞子集之间存在差异 (图6)。大簇 (标签10) 的特征在于S100A8的高表达和FCER1A的中等表达；其中一个小簇 (标签1) 同时具有S100A8和FCER1A的高表达水平，而在另一个小簇 (标签2) 中，FCER1A大多不表达。实验还研究了调节/记忆/辅助T细胞的三个簇 (标签6、9和12)。这三个簇由八个潜在的标记基因 (ACTG1，ATP5C1，CCT8，CIRBP，DUSP1，FLNA，FOS和GAPDH) 表达支持：同一簇中的细胞具有相似的表达模式。这个例子表明，scImpute提供了发现新的细胞亚群及其标记基因的机会。

图6. scImpute可帮助识别PBMC数据集中的细胞亚群

四、总结

本文提出了一种统计方法scImpute，以解决在scRNA-seq数据中普遍存在的“dropout”事件。 scImpute专注于插补“dropout”基因的缺失表达值，同时大程度保留不受“dropout”事件影响基因的表达水平。因此，scImpute可以减少因scRNA-seq引起的技术变异，并更好地代表了细胞间的生物学变异，同时还避免了在插补过程中引入过多的偏倚。对模拟和真实数据的综合研究表明，与原始scRNA-seq数据相比，scImpute插补的数据可以更好地显示细胞类型同一性，并获得更准确的DE分析结果。除上述描述的实验外，此文还设计了许多其他有借鉴意义的验证实验，感兴趣的读者可以下载原文以及其补充材料来进行阅读。

代码

https://github.com/Vivianstats/scImpute

参考文献

Wei V L , Li J J . An accurate and robust imputation method scImpute for single-cell RNA-seq data[J]. Nature Communications, 2018, 9(1):997.