基于LC-MS/MS分析体内外稳定同位素标记的中心碳代谢及相关途径

该文提出了基于靶向串联质谱分析（LC-MS / MS）的方案，以分析13C或15N标记的中心碳代谢及相关途径的性代谢物。

提出了一种基于靶向串联质谱分析（LC-MS / MS）的方法，用于分析性代谢物的13C或15N标记情况。该平台利用三重四杆（QQQ）质谱仪，性切换的选择性反应监测模式（SRM）和酰胺亲水作用液相色谱（HILIC），捕获碳和氮在选定代谢物中的离子对。本方案是对先前发表的非标记靶向代谢组学方案的扩展，并已广泛用于追踪各种生物样本（例如，体外细胞培养实验和经静脉注射小鼠体内标记）中营养物质的代谢，如13C标记的葡萄糖，13C-谷氨酰胺和15N-谷氨酰胺等。对SRM信号进行积分，生成每种标记形式的峰面积阵列。将处理后的数据用于获得目标分子标记的程度和分布（称为代谢流量组学）。每种方法都可以基于已知的未标记Q1 / Q3 SRM离子对而定制，并根据相应的13C或15N标记情况进行调整。从标记实验、代谢物提取到峰积分，单个样品的整个过程大约需要6-7小时。

实验步骤

1 提取代谢物并添加同位素标记。代谢物可以从多种不同的生物来源样本中提取，根据样本类型和实验目的选择相应的提取方法，然后考察确定标记时间。

2 设置MS方法。根据正负离子检测模式调整Q1 / Q3 SRM离子对列表，匹配每种代谢物的13C或15N标记类型。

3 将样品重悬于约20-25 µL LC-MS级水中，然后通过自动进样器进样5 µL，使用步骤2中Analyst软件中定义的靶向采集方法。

4 使用分析和峰积分软件（例如SCIEX的MultiQuant），在质谱图中查找13C/15N标记峰以及未标记的12C峰。

5 作为SRM的替代方法：可以进行高分辨率LC-MS / MS分析，高分辨质谱仪应在MS和MS / MS模式下均具有高质量精度且有性切换功能，例如QExactive Orbitrap的数据相关采集（DDA）模式。

结果

此平台可用于分析未标记（12C或14N）和标记（13C或15N）的代谢物。应根据生物学问题选择靶向SRM LC-MS/MS方法，提供了超过140个全标记代谢物的分析方法和多达40-50个独特代谢物的同位素分析。图1 是靶向13C代谢组学工作流程，展示了从代谢物提取、LC-MS / MS采集到数据统计分析的整套流程。

图1 靶向13C代谢组学工作流程

图2是胰腺癌细胞系的代谢流分析。用13C-葡萄糖和13C-谷氨酰胺对癌细胞系中心碳代谢进行标记，通过分别追踪U13C-葡萄糖或U13C-谷氨酰胺（平行实验）来分析中心碳代谢过程中的13C标记情况。

     除葡萄糖和谷氨酰胺外，还可以用任何参与目标代谢途径、含重原子的分子标记细胞。例如，使用在酰胺位置标记的15N-谷氨酰胺或13C4-天冬氨酸。发现mTORC1通过嘧啶从头合成途径提高了细胞中N-氨甲酰天冬氨酸通量的水平。15N和13C标记的N-氨甲酰天冬氨酸以及尿苷一磷酸（UMP）验证了这一点。图3的数据表明，可以使用多个标记源来考察通过一条途径的同位素异数体通量，以确定特定分子的碳或氮流来源。

38274-25-8 1,4-丁烷二醇-2,2,3,3-D4 1,4-Butanediol-2,2,3,3-d4

1189876-86-5 1-萘甲醇-D7 1-Naphthalenemethanol-d7

229948-67-8 4-溴甲苯-D7 4-Bromotoluene-d7

78585-66-7 3-甲基苄醇-D3 3-Methyl-d3-benzylalcohol

137219-34-2 9-芴酮-D8 9-Fluorenone-d8

75736-49-1 十六烷酸-D4 Hexadecanoic-7,7,8,8-d4acid

52089-63-1 1,4-二溴丁烷-2,2,3,3-D4 1,4-Dibromobutane-2,2,3,3-d4

68661-10-9 苄醇-2,3,4,5,6-D5 Benzyl-2,3,4,5,6-d5alcohol

285132-88-9 4-氨基苯酚-D7 4-Aminophenol-d7

正丁酸-D7

112484-85-2 对溴甲苯-D4 4-Bromotoluene-2,3,5,6-d4

4-Amino-2,6-dichlorophen-3,5-d2-ol

78646-17-0 水杨酸-D4 2-Hydroxybenzoic-3,4,5,6-d4acid

93111-25-2 4-氟苯甲酸-D4 4-Fluorobenzoic-d4acid

苯并(A)芘-D12

十二烷酸-D23 Dodecanoic-d23acid

十八酸-D35 Octadecanoic-d35acid

1000869-26-0 1-萘基-2,3,4,5,6,7,8-D7-硼酸 Boronicacid,b-(1-naphthalenyl-2,3,4,5,6,7,8-d7)-

1173019-62-9 4-壬基酚-2,3,5,6-D4 4-Nonylphenol-2,3,5,6-d4

51624-40-9 4'-溴-1,1'-联苯-2,3,4,5,6-D5 4'-Bromo-1,1'-biphenyl-2,3,4,5,6-d5

142475-00-1 1,1'-联苯-2,2',3,3',4,5,5',6,6'-D9 1,1'-Biphenyl-2,2',3,3',4,5,5',6,6'-d9

126866-27-1 4-溴-1,1'-联苯-2,3,5,6-D4(9Ci) 1,1'-Biphenyl-2,3,5,6-d4,4-bromo-(9ci)

51624-39-6 3'-溴-1,1'-联苯-2,3,4,5,6-D5(9Ci) 1,1'-Biphenyl-2,3,4,5,6-d5,3'-bromo-(9ci)

344298-97-1 [1,1'-联苯-2',3,3',4,4',5,5',6,6'-D9]-2-胺(9Ci) [1,1'-Biphenyl-2',3,3',4,4',5,5',6,6'-d9]-2-amine(9ci)

51624-38-5 2'-溴-1,1'-联苯-2,3,4,5,6-D5 1,1'-Biphenyl-2,3,4,5,6-d5,2'-bromo-

64420-95-7 2'-氟-1,1'-联苯-2,3,4,5,6-D5 1,1'-Biphenyl-2,3,4,5,6-d5,2'-fluoro-(9ci)

1020718-93-7 [1,1'-联苯-2,2',3',4,4',5,5',6,6'-D9]-3-胺 [1,1'-Biphenyl-2,2',3',4,4',5,5',6,6'-d9]-3-amine

78832-54-9 2-萘酚-D7 2-Naphthol-d7

124251-84-9 1-萘酚-D7 1-Naphthol-d7

180028-20-0 3,4-二羟基苯甲醛-D3 3,4-Dihydroxybenzaldehyde-d3

35530-94-0 3,3,5,5-吗啉-D4 Morpholine-3,3,5,5-d4

342611-08-9 4-氨基苯甲酸乙酯-D4 Benzocaine-d4

171777-66-5 4-硝基苯甲酸-D4 4-Nitrobenzoic-d4acid

1162658-07-2 3,4-二(甲氧基-D3)苯乙胺 3,4-di(Methoxy-d3)benzeneethanamine

53907-55-4 异烟酸-D4 Isonicotinic-d4acid

氘代己酸-D11 Hexanoic-d11acid

130131-94-1 己基溴-D13 1-Bromohexane-d13

25319-52-2 2-(甲基-D3)溴苯 2-(Methyl-d3)bromobenzene

93952-04-6 二苯并呋喃-D8 Dibenzofuran-d8

104959-27-5 1H-吲哚-2,3,4,5,6,7-D6 1H-Indole-2,3,4,5,6,7-d6

151985-13-6 2-甲基苯胺-D3 2-(Methyl-d3)aniline

87976-26-9 邻苯二甲酸-D4 Phthalicacid-d4

84965-36-6 丁醛-D8 Butanal-d8

4122-13-8 乙醛-D Acetaldehyde-1-d1

19901-15-6 乙醛-2,2,2-D3 Acetaldehyde-d3

30470-60-1 金刚烷-D16 Adamantane-d16

1219795-28-4 2-氯苯甲酸-D4 2-Chlorobenzoicacid-d4

25319-54-4 1,2-二甲基-D6-苯 O-xylene-d6

350820-13-2 犬尿喹啉酸-D5 Kynurenicacid-d5

50348-93-1 2-氨基异丁酸-D6 2-Methylalanine-d6

291765-93-0 1,2-苯二胺-D4 1,2-Benzene-d4-diamine

3972-52-9 2-氘代吲哚 Indole-2-d

57754-36-6 3-氘代吲哚 Indole-3-d

358730-95-7 4-壬基酚-2，3，5，6-D4，Od 4-Nonylphenol-2,3,5,6-d4,od

207569-03-7 1-萘酚-D8 1-Naphthol-d8

75-50-3UN 三甲胺-D9 Trimethylamine-d9

23346-25-0 对甲基苯胺-D3 4-(Methyl-d3)aniline

2041-42-1 噻吩-D2 Thiophene-2,5-d2

54299-27-3 2-溴-5-甲基苯-1,3-D2 Benzene-1,3-d2-2-bromo-5-methyl

98600-50-1 4-溴苯酚-2,6-D2 Phen-2,6-d2-ol,4-bromo

78405-35-3 脲-13C,15N2 Urea-13c,15n2

203805-87-2 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸-D18 N-2-hydroxyethylpiperazine-n′-ethanesulfonicacid-d18

143827-20-7 肌酸酐-(甲基-D3) Creatinine-d3

2120097-66-5 环己烷-1,2-二胺-D10 1,2-Cyclohexane-d10-diamine

66148-14-9 3-溴吡啶-D4 3-Bromopyridine-d4

1124-18-1 甲苯-D3 Toluene-d3

1603-99-2 甲苯-2,3,4,5,6-D5 Toluene-d5

98815-54-4 4-(乙酰基-D3)-溴苯 4-(Acetyl-d3)-bromobenzene

/ 3,5,6-三氘代-4-氨基-2-氟苯酚

93111-27-4 4-氟苯甲醛-2,3,5,6-D4 4-Fluorobenzaldehyde-2,3,5,6-d4

十六烷酸-D31

19361-62-7 苯乙烯-D8 Styrene-d8

126840-36-6 辛基溴-D17 1-Bromooctane-d17

54840-57-2 甲基丙二酸二乙酯-D3 Diethylmethyl-d3-malonate

350818-65-4 2,3-二甲基吡啶-D9 2,3-Dimethylpyridine-d9

1219805-81-8 4-羟基苯甲酸苯甲酯-D4 Benzyl4-hydroxybenzoate-2,3,5,6-d4

153466-65-0 双氯芬酸D4 Diclofenac-d4

35692-88-7 甲酰胺-1-D Formamide-1-d1

22583-75-1 苯甲酮-D10 Benzophenone-d10

6923/1/9 1H-咪唑-D4 Imidazole-d4

102910-30-5 烯丙醇-D5 Allyl-d5alcohol

60153-90-4 1-甲基-D3环丙醇 1-Methyl-d3-cyclopropanol

119176-67-9 1,9-壬二酸-D14 1,9-Nonanedioic-d14acid

97781-16-3 乙酰水杨酸-D4 2-Acetoxybenzoic-3,4,5,6-d4acid

1219803-74-3 己醛-D12 Hexanal-d12

1241045-80-6 4-氨基环己醇-D10 4-Aminocyclohexanol-d10

3972-26-7 异丙醇-2-D1 2-Propan-2-d-ol

3997-89-5 环戊酮-2,2,5,5-D4 Yclopentanone-2,2,5,5-d4

89924-82-3 环丙烷羧酸-D4 Cyclopropane-2,2,3,3-d4-carboxylicacid

1359833-48-9 7-溴萘-D7 Naphthalene-1,2,3,4,5,6,8-d7,7-bromo

56004-61-6 邻二甲苯-D10 O-xylene-d10

153557-95-0 环丙胺-D5 Cyclopropylamine-d5

16649-49-3 乙酸酐-D6 Aceticanhydride-d6

126840-15-1 邻苯二甲醚-D4 1,2-Dimethoxybenzene-3,4,5,6-d4

1093384-99-6 5-氯-2-氨基吡啶-3,4,6-D3 5-Chloro-2-pyridinamine-3,4,6-d3

352431-23-3 对甲基苯胺-D9 P-Toluidine-d9

152404-44-9 4-溴苯酚-2,3,5,6-D4 4-Bromophenol-2,3,5,6-d4

5-甲基吗啉-3-氨基-2-恶唑烷基酮-D5 3-amino-5-(4-morpholinylmethyl-d2)-2-oxazolidinone-4,4,5-d3

1246820-57-4 3,4-二氨基甲苯-D6 3,4-Diaminotoluene-d6

1020720-09-5 5-溴-6-硝基苯-1,2,3,4-D4 1-Bromo-2-nitrobenze-d4

1219798-78-3 邻苯二胺-D8 1,2-Phenylenediamine-d8

64531-29-9 苯并咪唑-4,5,6,7-D4 Benzimidazole-4,5,6,7-d4

1374664-60-4 2-溴-4-甲基吡啶-D6 2-Bromo-4-methylpyridine-d6

1643543-24-1 2-溴-4-(叔丁基-D9)-吡啶 2-Bromo-4-(tert-butyl-d9)-pyridine

1185306-03-9 2-溴-5-(甲基-D3)-吡啶 2-Bromo-5-(methyl-d3)-pyridine

15502-50-8 均四甲苯-D14 1,2,4,5-Tetramethylbenzene-d14

1354892-73-1 3,5-二甲氧基苯甲醛-D6 3,5-Dimethoxybenzaldehyde-d6

78832-61-8 2-羟基萘-D8 2-Naphthol-d8

123-62-6UN 丙酸酐-D2 Propanoic-2,2-d2anhydride

20201-29-0 异丙苯-D6 2-Phenylpropane-1,1,1,3,3,3-d6

72182-69-5 异丁醇-D6 2-Methyl-d3-propyl-3,3,3-d3alcohol

42983-07-3 三甲基乙酸-D9 Trimethyl-d9-aceticacid

52089-62-0 丁二酸二乙酯-2,2,3,3-D4 Diethylsuccinate-2,2,3,3-d4

1219798-53-4 对乙酰氨基酚-D7 N-(4-hydroxyphenyl-2,3,5,6-d4)acetamide-2,2,2-d3

284474-77-7 1,3-丙二醇-D6 1,3-Propane-d6-diol

1076-07-9 苯乙酸-2,2-D2 Phenylacetic-2,2-d2acid

1219802-12-6 水杨酸甲酯-D4 Methyl2-hydroxybenzoate-d4

42932-62-7 5-溴戊酸-3,3,4,4-D4 5-Bromopentanoic-3,3,4,4-d4acid

93951-91-8 3,3-二氯联苯胺D6 3,3'-Dichlorobenzidine-d6

1173021-85-6 四咪唑-D5盐酸盐 Tetramisole-d5hydrochloride

13122-33-3 溴苯-4-D1 Benzene-d,4-bromo-

13122-34-4 氯苯-4-D1 1-Chlorobenzene-4-d

1158734-28-1 1,4-二羟甲基苯-D4 1,4-di(Hydroxymethyl)benzene-d4

202468-69-7 1,2-环氧丙烷-D6 1,2-Propylene-d6oxide

109930-25-8 糠醇-D2 Furfurylalcohol-d2

75736-47-9 软脂酸-D4 Palmiticacid-d4

35468-44-1 溴代环戊烷-D9 Cyclopentyl-d9bromide

1093380-08-5 N-(甲基-D3)-哌嗪 N-(Methyl-d3)-piperazine

207456-83-5 4-甲基-3-戊烯-2-酮-D10 4-Methyl-3-penten-2-one-d10

4303-49-5 丙二酸二乙酯-D2 Diethylmalonate-d2