【经验分享】NCBI设计引物 |
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引物设计参数
红色的表示需要改 绿色的表示不需要改 箭头表示普通PCR 接下来,我们需要简单地为引物设计设定一些参数 1. 输入目的模板: 2. 引物位置和产物大小(qPCR可以设置跨越两端的外显子的长度,PCR也可以控制左右引物位置)需要要求产物长度80--200bp,太短或者太长都不适合做荧光定量PCR检测,特别是荧光定量PCR的引物,要控制TM=60℃左右。 3. 是否跨越外显子区域当我们设计原核生物(如细菌、病毒等)序列的引物时,我们在“Exon/intron selection”处直接选择“No preference”; 而当我们设计真核细胞中的mRNA的引物时,为了防止产物中有DNA污染,我们通常将引物设计在跨外显子处,在“Exon/intron selection”中选择“Primer must span an exon-exon junction ”。 4. 特异性(Specificitycheck)选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。(重要) ◆ 提供了 7 种数据库:RefSeq mRNA,Genome (reference assemblies from selected organisms),RefSeqrepresentative genomes,RefSeq RNA(refseq_rna),nr (the standard non-redundant database),Genome (chromosomesfrom all organisms) 和 custom。 ◆ 前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。 ◆ 特别是,当你用 NCBI 的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST 可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。
同时,在下方高级参数设置处将引物的GC含量设置成40%-60%℃,最好45-55℃ 最后,点击最下方的“Get Primers”,即可得到引物设计的结果。我们通常可以得到1条至多条引物,在界面上按分数高低从上至下排列 下一博客将会分享NCBI输出结果解读,以及PCR的引物验证 |
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