亚硫酸氢盐处理后测序（bisulfite sequencing PCR,BSP）法是检测基因甲基化的经典方法，其原理为：用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶（C）被转化为尿嘧啶（U）而甲基化的胞嘧啶则不变。 基因组DNA经亚硫酸盐处理后，设计BSP引物扩增目的片段，此时尿嘧啶（U）全部转化为胸腺嘧啶（T），最后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生甲基化。 BSP实验流程:

引物设计及注意事项： 引物设计软件：Methyl Primer Express v1.0 引物设计注意事项：用于BSP实验的DNA是经过亚硫酸盐处理，将未甲基化的C碱基转变为U碱基，而甲基化的C碱基不变，从而将甲基化的差异转变成碱基上的差异，所以在后续进行PCR扩增引物设计的时候需要注意： 1、引物设计不能含有CpG位点，以避免造成发生甲基化和未发生甲基化DNA的差异。 2 、引物扩增的片段能包含尽量多的CpG位点，BSP扩增片段长度300-500bp，包含的CpG位点越多则引物的打分越高。 BSP服务完成时提供:    Bisulfite处理的基因组DNA；    实验报告(包括BSP产物的直接测序报告)。 结果展示： BSP测序图

BSP点状图

空点表示为发生甲基化的CpG位点，实点表示发生甲基化的CpG位点 BSP柱状图

案例分析： 利用二代测序和BSP(bisulfite sequencing PCR)研究MLH1 启动子区域甲基化状况在肿瘤内部的异质性 同一肿瘤中可能包含不同体细胞变异的细胞，过去对肿瘤的这种异质性研究主要集中在遗传学领域，作者则将目光锁定在表观遗传学方面。研究人员先利用二代测序手段，对来自33个样本(包括子宫内膜癌，相应的外周血以及正常的子宫内膜组织)的1000个分子的MLH启动子区域的甲基化谱(spectrum of MLH1 promoter methylation)进行研究，后续再利用BSP手段进行验证，发现了不同的子宫内膜癌细胞MLH1启动子区域出人意料的甲基化异质性形式，这种高分辨率的研究手段能够研究肿瘤甲基化的克隆性(clonality of methylation)从而对肿瘤发生过程中对启动子区域异常甲基化的状况进行研究。

BSP验证二代测序

原文：Intra-tumor heterogeneity of MLH1 promoter methylation revealed by deep single molecule bisulfite sequencing，Nucleic Acids Research，2009.

编辑: gaowei2010