上一期我们讨论了Cq的决定方式，这对数据质量的把关大有裨益；这一期讨论的是探针和引物设计的通用原则。

       根据使用的荧光化学物质的不同，可以将qPCR实验大致分为两大类：染料法（以SYBR Green I和Evagreen为代表）和探针法（荧光基团FAM等标记，Fig 1），下一期我们会讨论这两种方法的选择及不同的探针类型。染料法只需要设计引物即可进行实验，而探针法除了引物之外还需要探针的辅助。我们以探针法为例介绍扩增子选择、引物和探针设计的通用原则。

Figure 1. 常规的Taqman探针原理示意图

       扩增子是发生PCR反应的地方，也是PCR的产物。由于qPCR只是用于表征基因的数量，并不需要得到其全长序列，因此扩增子区段的选择具有相当的灵活性，在基因读码框的内部即可（mRNA的分析除外）。区段的选择一般遵循以下原则：

·      扩增子长度一般在75-200 bp范围。如果太长，扩增效率会降低；而太短又无法与引物二聚体区分开。

·      尽可能避免二级结构区域。这会极大的影响扩增效率。目前很多网站都可以在线预测二级结构，操作简单，如http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form。

·      尽可能避免单碱基连续重复超过4次（如AAAA、CCCC等）。但有时在扩真核生物基因组时难以保证。

·      GC含量尽可能在50%-60%。这一点在扩增某些物种（如放线菌）基因组时同样难以保证。高GC模板扩增需要加入一些特殊成分来优化实验，目前也有商品化的试剂。

      引物用于启始PCR反应，其质量直接关乎实验成败。引物设计一般遵循以下原则：

·      长度在15-30 bp（一般为18-25 bp），GC含量尽可能在50%-60%。严重的比例失衡会导致引物二聚体增多。

·      Tm值在50℃-65℃。过高会导致扩增受影响（DNA聚合酶有一定的工作温度范围）；过低容易产生错配，特异性差。目前很多软件和网站可以预测引物的Tm值，要注意的是该值（包括引物合成单中的Tm）仅仅是预测，并不代表实际情况，PCR时最佳的退火温度需要通过温度梯度实验来得到。

·      避免匹配模板的二级结构区域。

·      避免连续出现三个以上G或者C碱基。引物中碱基分布最好是随机的，否则可能会在基因组中的GC密集区发生错误匹配。

·      3’端尽量安置G或者C碱基。GC配对的强氢键作用对于启始PCR反应具有更好的作用。

·      避免引物二聚体的出现。其中包括自身配对和上下游引物配对，这要求3’端序列尽可能不要出现大量碱基配对。

       完整的探针包括荧光基团、淬灭基团和寡核苷酸序列三部分，理想的探针应该具有特异性高、荧光本底低等特点。对于寡核苷酸序列的设计一般遵循以下原则：

·      GC含量30%-80%，C碱基要多于G碱基，长度一般15-30 bp。过长会影响淬灭效率，导致荧光本底较高；过短则导致特异性下降。

·      Tm值一般比引物的要高5-10℃。

·      5’端不能安置G碱基。G碱基本身具有荧光淬灭的特性，会导致荧光基团被切掉后也无法发出荧光。

       荧光基团根据检测的多重性灵活选择，一般首选常规的FAM和HEX，同时针对不同的荧光基团选择合适的淬灭基团（Tab 2）。淬灭基团一般首选BHQ系列。

Table1. 荧光基团及对应的淬灭基团

       下一期讨论如何在染料法和探针法之间做出选择，以及探针的不同类型。接下来我们还会展示如何在线设计引物和探针，以供参考。

       不知道今天大家有没有吃到饺子？年关已到，希望大家2020都能实现自己的理想乃至梦想，大的小的，近的远的。

参考文献

1.     Bio-RadLaboratory. “Real-Time PCR Application Guide”. Bulletin #5279.