100管/48样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+)含量和NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。 测定原理 分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH,从而检测 NADP+含量。 所需的仪器和用品 酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。 试剂的组成和配制 酸性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 碱性提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存; 试剂一:液体 10 mL×1 瓶,4℃保存; 试剂二:粉剂×1 支,-20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4 ℃保存一周; 试剂三:粉剂×1 支,-20℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周; 试剂四:粉剂×1 支,4 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周; 试剂五:液体 3.6mL×1 支,4 ℃保存; 试剂六:液体 30mL×1 瓶,4 ℃保存; 试剂七:液体 50mL×1 瓶,4 ℃保存。 NADP+和 NADPH 的提取 1 血清(浆)中 NADP+和 NADPH 的提取NADP+的提取:

按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中 和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 2 组织中 NADP+和 NADPH 的提取: NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约 0.1g组织,加入 1mL 酸性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和, 混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议取约0.1g 组织,加入 1mL 碱性提取液),冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 3 细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取: NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):酸性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min (盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。NADPH 的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μL 上清液,加入 500μL 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。 测定步骤: 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。 2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样):

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