图2

目前寡核苷酸生物分析方法主要有HPLC、LC-MS、ELISA、RT-qPCR等，本文主要介绍基于LC-MS技术在寡核苷酸药物生物分析中的应用。

1样品前处理

在生物基质中，含有各种复杂成分其中包括蛋白质，磷脂，大量盐类以及其他有机和无机物质等，在使用LC-MS进行检测会产生比较明显的基质效应。此外寡核苷酸药物经过修饰后，有较高的血浆蛋白结合率，因此为使LC-MS分析能够顺利进行，需要在样品预处理阶段去除生物样品中的盐和蛋白质。一般常规样品前处理主要包括蛋白质沉淀（PPT），液液萃取（LLE）和固相萃取（SPE）。PPT虽然操作简单迅速，成本低，但由于回收率低，存在明显的基质效应，所以基本上不推荐使用这种方式进行前处理。一般采用LLE、SPE，或者LLE和SPE联合使用，可以获得较高的回收率，同时降低基质效应的影响。

LLE法在寡核苷酸提取过程中属于常见的一种提取方式，比较常用的萃取剂为苯酚-氯仿，在此基础上也可以进行优化，比如加入异丙醇进行沉淀，去除基质中蛋白降低基质效应。同时也需要根据化合物性质，调节pH值，比如加入氨水等，来提高寡核苷酸药物在水相中的溶解性。另外还可以使用RNA提取试剂Trizol来提取寡核苷酸，提取过程如图3所示。

图3

SPE法是提取寡核苷酸药物使用最广泛的处理方式。固相萃取的方法与色谱分离的原理相同，由于寡核苷酸药物极性很大，保留差，在在固相小柱活化和淋洗的过程中均需要使用离子对试剂缓冲液才能达到保留寡核苷酸和洗脱干扰基质的目的。目前市面上也有非常成熟的提取寡核苷药物的试剂盒，例如Clarity™OTX™萃取方案可有效去除掩盖目标寡核苷酸并影响分析结果的细胞碎片，包括蛋白质、基因组DNA和脂质。通过去除这些污染物，MS基线噪音可显著降低，从而简化定量生物分析的过程。SPE前处理示意图如图4所示。

图4

此外寡核苷酸在聚丙烯管和玻璃容器中均存在非特异性吸附，这严重影响检测重现性和准确度，因此可以加入表面活性剂来降低或者消除这一影响。在前处理过程中选择合适的耗材和试剂，例如无RNA/DNA酶的枪头、离心管和纯水等，对于实验结果也会产生较大的影响。

2色谱分离

寡核苷酸属于酸性强极性化合，在一般色谱柱上很难保留。针对寡核苷酸色谱法主要有离子对反相色谱（IP-RPLC）、离子交换色谱（IEC）、亲水作用色谱（HILIC）。其中离子对反相色谱法最为常用，如图5所示离子对试剂增强寡核苷酸在反相色谱上的保留原理主要基于两点：首先，带正电的离子对试剂会与带负电的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中构成离子对，减少了寡核苷酸的净电荷并增加了其疏水性，此时疏水相互作用促成了寡核苷酸在离子对反相色谱中的保留；再者，离子对试剂依靠其疏水性烷基链可以吸附于反相色谱的固定相上以形成离子交换剂（Ion exchanger），此时静电相互作用将帮助寡核苷酸在反相色谱中的保留。

离子对试剂的种类繁多，最常用离子对主要为基于乙酸胺试剂和基于六氟异丙醇（HFIP）的胺类离子对试剂。但基于 HFIP的离子对试剂较基于乙酸的离子更为常用，因为与乙酸相比，HFIP的沸点和酸性更弱，这意味着 HFIP 在电喷雾离子化的气相状态下更容易挥发，对寡核苷酸的离子化干扰更小，与电喷雾质谱更兼容。常见的离子对试剂主要有三乙胺（TEA）、醋酸三乙胺（TEAA）、碳酸三乙胺（TEAB）、六氟异丙醇（HFIP）。图6整理一些关于用于反义寡核苷酸的色谱方法参数。

图5

（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）

图6

（The Separation and Analysis of Oligonucleotides by Mass Spectrometry，2019）

3质谱检测

寡核苷酸由于其特殊结构，其每个磷酸二酯键上都带有1个酸性质子（PKa~1），这类化合物在ESI源负离子模式下响应较好。由于寡核苷酸含有多个核苷酸基团，在ESI源中发生去质子反应，在负离子模式下形成多重电荷离子，同时很容易结合金属离子，因此会分散质谱信号。此外随着寡核苷酸分子量的增加，其检测响应也会损失严重。因此对这类化合物需要优化质谱条件，改善多电荷分布，同时减少待测物在质谱分析加合离子形成。主要通过调节溶液pH值，阳离子浓度和有机溶剂组成来消除或者降低上述因素的影响。在色谱分离中已经提及需要使用到离子对试剂，在一开始方法开发阶段，寻找子母离子也必须使用离子对试剂，否则很难找到对应的子母离子碎片，然后基于此条件下再进行质谱参数的优化，可能会获得比较好的信号响应。

由于寡核苷酸药物适应症涵盖范围广，包括肿瘤、罕见病（肌萎缩性脊髓侧索硬化、杜氏肌营养不良、脊髓性肌萎缩）、病毒性疾病、肾脏疾病、心血管疾病、炎症类疾病、代谢类疾病（糖尿病）等，有望掀起继小分子化药、抗体药物之后又一次新药研发浪潮。虽然其在生物分析方面存在诸多挑战，但熙宁生物拥有专业的质谱团队，能够为客户提供各种解决方案，切实解决分析中的各种难题，为新药研发贡献一份力量。

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