对来自8个原发性肿瘤和3个转移性肿瘤的59915个单细胞进行了基于微滴的单细胞RNA测序（sRNA-seq），分析得到所有GEP预后亚型和BSE突变类别（图1a）。使用t-SNE的降维分析揭示了肿瘤和非肿瘤细胞类型的多样性（图1b）。正如所料，根据基于GEP的临床预后分类，肿瘤细胞聚集最为强烈，主要分裂发生在1类（BAP1野生型）和2类（BAP1突变型）肿瘤之间（图1c）。单个肿瘤的组成差异很大，细胞复杂性从原发性1类肿瘤增加到转移性2类肿瘤（图1d）。有趣的是，在12个组成验证GEP临床预后试验的基因中，5个如预期的那样主要在肿瘤细胞中表达（EIF1B、HTR2B、ECM1、CDH1和ROBO1），但1个主要在T细胞中表达（SATB1），其余6个在肿瘤细胞和免疫细胞中同时表达。

图1

二、单细胞CNV分析

接下来，作者使用CNVs作为一种手段来探测每个肿瘤的克隆结构。单个细胞的CNV含量通过使用inferCNV从scRNA-seq数据确定（其与scDNA-seq正交验证）。利用隐马尔可夫模型和贝叶斯潜在混合模型确定亚克隆CNV事件，去除低置信度CNV。这一分析揭示了以前在规范和非规范CNV中未被重视的复杂性（图2a-c）。正如预期的那样，典型CNV在染色体上占主导地位，但在样本中存在多个亚克隆的典型CNV和非典型CNV。

令人惊讶的是，1类肿瘤含有典型的2类CNV亚克隆（例如1p、3和8p缺失），2类肿瘤含有典型的1类CNV亚克隆（例如6p和6q获得）。此外，典型的CNV并不总是发生在一个单一的事件，但可以产生于正在进行的基因组进化。例如，5个病例（BSSR0022、UMM062、UMM063、UMM065和UMM067L）显示有证据表明，最初增加8q，随后增加8p。在UMM065中，在23%的亚克隆中丢失3q，随后在6%的亚克隆中丢失3p。尽管含有LOH3细胞，但该肿瘤的GEP为1类，很可能是因为LOH3位于一个小的亚克隆中，并且没有发生BAP1突变，这与2类GEP需要LOH3和BAP1在3号染色体的另一个拷贝上突变的概念一致。

以前的研究表明，典型的基因组畸变出现在UM的早期，并引起与特征性驱动突变相关的三个主要进化轨迹之一——1A类的EIF1AX，1B类的SF3B1和其他剪接突变，以及2类肿瘤的BAP1，然而，我们目前研究结果的单细胞分辨率显示，这些肿瘤随着迄今未被认识的非标准CNV亚克隆的发展而不断进化，这些亚克隆可能有助于肿瘤的进展。

图2

三、细胞轨迹分析

在皮肤黑色素瘤中，越来越多的证据表明肿瘤细胞在转录状态之间发生可逆的转换。为了阐明UM细胞的转录状态，作者首先使用scenict分析scRNA-seq数据，以确定潜在的共表达模块及其相关的顺式调控元件。最过度表达的motifs（肿瘤蛋白MYC和JUN），以及bHLH-PAS缺氧相关转录因子ARNT，所有这些motifs都在2类肿瘤细胞中富集（图3a）。

然后，作者使用Monocle 2分析了scRNA-seq数据，它重建了假定的分支转录轨迹，以确定计算不同细胞状态之间的潜在关系（图3b-d）。所有肿瘤细胞的伪时间顺序产生总共16个状态，并形成两个主要分支，根据GEP类别1和类别2自我分类（图3b，c）。在单个样本水平上，来自1类肿瘤的细胞在状态1-4、14-16富集，来自2类肿瘤的细胞在状态5-13富集（图3d），证实了1类/2类划分是UM分子格局的基本特征。

作者使用分支表达分析模型（BEAM）和层次聚类法分别分析每个样本的细胞的轨迹，以确定跨状态富集的基因（图3e）。与先前的研究一致，转录状态被鉴定为富含表达HLA I类基因的细胞，以及与黑素细胞分化（PMEL）和TNF-α/NF-κB信号（FOS，FOSB，JUN，JUNB，EGR1）相关的状态。

图3

四、免疫细胞和V(D)J免疫谱分析

肿瘤细胞在转录状态间的适应性可塑性是由来自TME的信号驱动的，作者通过生成免疫细胞的t-SNE图（图4a）和对肿瘤样本中每个簇的平均基因表达进行分层聚类（图4b）来研究TME。所有样本中均存在T细胞，包括CD8细胞毒性T细胞和CD8T效应记忆细胞（图4c）。大多数T细胞是CD8，CD4细胞的数量较少，包括滤泡辅助细胞、FOXP3调节细胞和淋巴细胞。

对来自scRNA-seq数据的T和B细胞受体的V（D）J重组分析显示，只有三个样本（图4d）中克隆扩增的T细胞，都是2类原发性肿瘤。相关免疫检查的分子CD8T细胞表达对于LAG3最强，对于TIGIT可变，对于PDCD1（PD1）、CTLA4、HAVCR2（TIM3）和TNFRSF9最小（图4e）。使用多色IHC在18个样本中验证LAG3、CTLA4和PD1的蛋白表达（图4f、g）。

这些发现，再加上PD-L1和PD-L2在肿瘤细胞中的表达可以部分解释CTLA4和PD1阻断在转移性人类中的无效性，并提示LAG3在UM中T细胞衰竭中的潜在作用。与其他癌症类型的发现相似，LAG3也在一些CD4T细胞、Foxp3调节性T细胞、NK细胞和巨噬细胞/单核细胞中表达。CD14单核细胞/巨噬细胞存在于所有原发性和转移性样本中，CD68巨噬细胞显示从M1-到M2极化的光谱（图4b、c）。B细胞和浆细胞在大多数样本中很少见。然而，值得注意的是，从原发性1B类肿瘤治疗29年后发生的孤立性缓慢生长的肝转移瘤中获得的激发性样本（BSSR0022）含有克隆性扩增的浆细胞，表明抗体介导的免疫促进了异常持久和无痛的临床行为。

图4

总结

这些发现揭示了肿瘤和免疫细胞的复杂生态系统，并表明它们沿着与特定基因组畸变相关的轨迹共同进化。有趣的是，推测1类UMs的长潜伏期和低转移率可能至少部分是由于免疫监视，这可能是由EIF1AX和SF3B1突变产生的新抗原引起的。这种可能性可能具有临床意义，值得进一步研究。相比之下，2类肿瘤的典型基因组畸变和总体非整倍体的增加创造了一个免疫抑制微环境，通过免疫逃逸促进转移。

通过免疫组库分析显示在UM样本中克隆扩增的T细胞或浆细胞表明肿瘤浸润的免疫细胞能够产生反应，这表明肿瘤低突变不是UMs对检查点抑制剂反应差的唯一解释。事实上，作者发现LAG3是UM的主要标志物，至少可以部分解释先前针对CTLA4和PD1的检查点阻断的失败。LAG3是第三个靶向于患者的免疫抑制受体，与PD1具有相当大的协同作用，不仅在CD8T细胞上表达，而且在NK细胞和调节性T细胞上表达，并且具有独特的特性，可以显著扩大检查点抑制剂治疗的疗效。因此，LAG3抑制剂正在多种癌症类型的大量临床试验中进行评估。

文：CXC

排版：市场部

文献下载：

https://international.biocloud.net/zh/article/detail/31980621

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