CRISPR/shRNA文库及其在遗传筛选中的应用

CRISPR文库

CRISPR文库是一个强大的用于编码或非编码区域的大规模或全基因组功能筛选工具，可涉及特殊通路、疾病、细胞药物应答、发育、基因调控等。下表列出并比较了常用的基于CRISPR文库的筛选类型：

除构建定制CRISPR文库外，我们还提供高质量的预制dual-gRNA文库，可打靶人类或者小鼠基因。我们的人和小鼠dual-gRNA慢病毒预制文库可分别打靶20,048个人类基因和20,493个小鼠基因。每个基因被4-6对位于不同载体上的gRNA靶向。这些文库均经过NGS测序和功能验证。

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shRNA文库

shRNA文库可以在哺乳动物细胞中进行大规模或全基因组功能缺失筛选，是一个强大且经济实惠的工具。CRISPR基因敲除筛选的主要缺点是CRISPR会引入随机突变，使得针对给定靶位点的敲除效应在不同的细胞间差异较大。相比之下，shRNA文库的筛选对于特定靶基因的干扰效应，在不同细胞间的表现通常较为均一。

除了构建定制的shRNA文库之外，我们还提供高质量的针对人和小鼠基因的shRNA文库产品。对于每个物种，我们提供了两种规格的慢病毒shRNA文库产品：全基因组大库（针对约19,000个RefSeq基因）和精华基因小库（针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因），每个基因对应5-6个不同的shRNA。我们的shRNA文库已通过了NGS测序和功能验证。

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文库构建流程

设计文库构建方案

我们拥有强大的计算机资源和优化的流程。如果您没有备选的gRNA或shRNA序列，我们可以为您设计。您可根据研究需要，选择我们经过验证的载体骨架来构建文库，如慢病毒，腺相关病毒（AAV），piggyBac和常规质粒等。对于2-载体系统的CRISPR文库，我们还可以根据您的筛选策略，设计和构建相应的Cas9或Cas9变体表达载体。

构建CRISPR/shRNA文库

我们使用芯片合成的方法获得高质量的gRNA或shRNA引物库。以引物库为模板，使用最低有效循环数进行PCR扩增，并以平均100x的覆盖率克隆到目的载体骨架上。将CRISPR/shRNA文库质粒DNA转化大肠杆菌进行扩增培养后，取对数生长期的菌液制备成甘油菌进行保存。为了评估文库的质量，我们会对gRNA/shRNA质粒DNA库进行NGS测序分析，测序深度将达到>500x覆盖率，分析出来的数据将形成报告。

预制质粒DNA文库的扩增

我们可以为您扩增其他来源（例如Addgene）的预制质粒DNA文库。首先我们会将质粒DNA文库转化超级感受态细胞，达到>100x覆盖率，取对数生长期的大肠杆菌培养物制备成甘油菌。其次，我们还会对转化后的菌落进行计数以评估gRNA/shRNA实际平均数量。我们也提供质粒DNA文库的大提和病毒包装服务。

我们可以在转化前和/或转化后对您的质粒DNA文库进行NGS测序验证。对于您提供的质粒DNA文库，我们可以通过克隆计数保证达到100x覆盖率，但不能保证文库的多样性和均一性，因为我们无法控制您的预制质粒DNA库质量。

文库的病毒包装

对于CRISPR/shRNA文库筛选，您可能需要通过病毒（如慢病毒或腺相关病毒）将文库转到细胞中。我们研发出了一系列专利技术和试剂，大大改进了病毒包装的滴度、纯度、活性和均一性等。针对我们的病毒载体系统，我们也优化了病毒包装方法。因此，我们的客户满意度越来越高，客户群体越来越大，并且有很多发展成了长期合作的老客户。

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功能筛选样品的NGS测序分析

功能筛选后，不知道如何对细胞样品进行NGS数据分析？您可以直接将基因组DNA样品寄送给VectorBuilder，我们将为您制备NGS样品、高通量测序和数据分析，并在短短几周内告知您样品的gRNA/shRNA的分布情况。

测序完成后，我们会通过电子邮件通知您，并给您发送用于下载原始测序数据和数据分析报告的FTP链接。您的数据将免费保存3个月，您也可以申请延长存储数据的时间。

客户提供文库质粒

如果您需要使用您的文库质粒构建文库，请按照外来物品接收指南将质粒寄送给我们。请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。客户提供的所有材料均需经过QC检测，每一份材料附加检测费用。请注意，客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。对于使用客户文库质粒构建的文库，我们无法保证文库的多样性和均一性。

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