CRISPR/Cas9 (Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein 9) 技术是最近发现的一种基因组靶向修饰技术。与之前的技术相比，CRISPR/Cas9技术是通过一段RNA来识别靶位点，因而在设计和构建上更加简单。迄今为止，CRISPR/Cas9技术已成功应用于肺炎链球菌Streptococcus pneumoniae、大肠杆菌Escherichia coli、芽殖酵母Saccharomyces cerevisiae、秀丽线虫Caenorhabditis elegans、果蝇Drosophilamelanogaster、斑马鱼Danio rerio、小鼠Mus musculus、大鼠Rattus norvegicus、拟南芥、玉米Zea mays、水稻和小麦Triticum aestivum以及包括iPS细胞在内的人体外培养细胞系等多个物种内源性基因的定点修饰。因此CRISPR/Cas9 载体设计与构建非常重要。

当外源DNA入侵细菌时，其CRISPR系统会特异性地捕获一段被称为proto-spacers的外源DNA序列插入到前导序列与间隔重复序列之间，并伴随一次重复片段的复制，这样就形成了一段新的重复单元，这些重复单元就是细菌特异性免疫的结构基础。需要注意的是，外源DNA的捕获并不是完全随机的，在这些被捕获的DNA序列下游常有一段序列保守的特殊结构，被称为PAM位点PAM位点的存在可能是CRISPR系统区分自身DNA与外源DNA而避免发生自身免疫的机制之一，同时也是基因编辑时靶序列选择的重要要求。之后，形成的重复单元会被转录形成前体CRISPR RNA (Pre-crRNA)，在RNase Ⅲ的作用下成熟。成熟的crRNA与tracrRNA通过碱基配对形成双链RNA结构，并进一步与Cas9蛋白结合形成靶向切割复合体对外源DNA进行特异切割，达到识别和降解外源DNA的目的。

根据上述原理，只需合成定制的crRNA，将其插入到合适的质粒中，与分别表达tracrRNA和Cas9蛋白的质粒共转染细胞，或体外转录成RNA后注射到特定细胞中，就可以建立基因敲除的细胞系或动物模型。crRNA的作用是通过碱基配对识别基因组靶序列，而不需要像ZFN和TALEN那样构建复杂的识别蛋白，极大简化了试验流程。另外，与ZFN和TALEN技术中用到的FokⅠ不同的是，Cas9蛋白存在HNH和RuvC两个活性位点可以分别切割与crRNA互补的DNA链和非互补链，从而引入DSB，不需形成二聚体发挥作用，而且切割活性特别高。Jinek等[44]还发现，将crRNA：tracrRNA双链RNA结构改造成单链导向RNA (Single-guide RNA，sgRNA) 同样能够指导 Cas9蛋白特异切割双链DNA，这进一步提高了操作简便性

CRISPR/Cas9 载体设计与构建方法1：利用试剂盒快速方便地将gRNA 靶点序列插入到Cas9/gRNA 质粒中。构建好的Cas9/gRNA质粒能够同时表达植物密码子优化的Cas9 蛋白及gRNA，应用CRISPR 技术进行目标基因的敲除和编辑。

CRISPR/Cas9 载体设计与构建方法2：根据NtDXR 基因序列，利用在线工具ZiFiT Targeter Version4.2:选择合适的靶位点，筛选要求为：①靶位点主要包括20 个碱基，并且这20 个碱基后面是NGG（N 为任意碱基）3 个碱基的PAM 区（Protospacer adjacent motif，PAM）；②靶位点尽量选择在基因编码区的前端。依据靶位点设计原则设计引物，上游引物DXR-K-F 为5'-GATTGGAGTGGGAT  TTCTGGTAAG-3'，下游引物DXR-K-R 为5'-AAACCTTACCAGAAATCCCA CTCC-3'。靶位点DNA双链的退火反应体系：5×Annealing Buffer for DNA Oligos 4 μL，上下游引物各4 μL（50 μmol/μL），Nuclease-free water 补至20 μ L。反应程序：95 ℃ 5 min，每8 s 下降0.1℃，直至25 ℃（约90 min）；4 ℃保存。将退火反应得到的产物连接到经Bsa I 酶切的CRISPR/Cas9载体pORE-Cas9/ gRNA上。连接体系：退火产物2μL，酶切产物3 μL，10×T4 DNA Ligase Buffer 2μL，T4 DNA Ligase（400 U/μL）1 μL，无菌水补至20 μL。连接产物转化Trans-T1受态细胞，筛选阳性克隆，用载体上的序列作为上游引物U26-jiance-F（5'-TTAGGTTTACCCGCCAATA-3'）、目的基因上靶位点的反向互补序列为下游引物DXR-K-R（5'-AAACCTTACCAGAAATCCCACTCC-3'）对菌斑进行菌落PCR。经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，进行测序验证。

[1] CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展.

[2] 利用CRISPR/CAS9 技术编辑水稻香味基因Badh2

[3] 基于CRISPR/Cas9技术的烟草NtDXR基因敲除及功能分析