随着 CRISPR 基因敲除（KO）细胞系在抗体验证方面到蛋白质组研究等应用中的使用增多，许多研究人员正在探索如何在自己的实验室内构建 CRISPR 敲除细胞系以及最有效的构建方法。

CRISPR 敲除细胞系的标准构建流程包括从项目计划到确认细胞系中所需 CRISPR 编辑共 5 个主要步骤。这些步骤为：

实施所涉及的许多不同方法中，每一步都要仔细考量并且需要一定的技术上的技巧。

向导RNA设计和制备

向导 RNA 识别靶基因区域，并将基因编辑系统引导至 DNA 的目标位点。构建 CRISPR敲除细胞系时，可以使用多种形式的向导RNA；单向导 RNA（sgRNA）、cr:tracrRNA 的两部分寡核苷酸系统、体外转录 RNA、质粒和慢病毒。

虽然质粒和慢病毒的使用技术可能更为大家所熟知，但它耗时长，需要筛选试剂，并且容易发生脱靶编辑。但是，慢病毒在难转染细胞的转染方面具备一些优势。使用 sgRNA 可以减少脱靶效应并且节省时间。使用多个 gRNA 可以提高获得所需编辑的机率，并节省后续克隆选择阶段的时间2。但是这些 gRNA 必须正确打靶。

转染

确定 CRISPR 敲除策略后，就要确定最有效的细胞转染方法。许多研究人员都认为，这是 CRISPR 工作流程中最难的一步3；要想将 CRISPR 基因编辑系统准确地递送到细胞中，通常需要对每种细胞类型的转染条件进行优化。

一些细胞类型，如干细胞、原代细胞以及免疫和造血细胞系，它们的细胞修复机制已被改变，而且细胞活性较低，因此较难转染。能否成功转染往往取决于是否具备所选细胞系方面的经验以及是否了解细胞特性。

富集和单细胞扩增

为了构建所需敲除的均质化细胞群，最好对单克隆进行挑选。该过程可以对敲除细胞进行充分表征，并对结果进行简单解释。富集可以减少获取克隆细胞群所需的细胞传代次数，从而提高后续实验中细胞群的健康状态。

但是，这些阶段会比较耗时，而且对技术要求较高，需要对多个克隆进行广泛筛选，从而识别所需的 CRISPR敲除的细胞。如果生长条件没有充分优化，可能会导致珍贵的细胞样本死亡，让您在构建 CRISPR敲除细胞系期间所做的工作前功尽弃。

验证您的 CRISPR敲除细胞系

构建好 CRISPR 敲除细胞系后，要充分验证特定基因的编辑效率是非常重要的。

在大多数情况下，为了确保后续研究中的细胞活性，需要对 CRISPR 敲除细胞系进行表征。通过多种方法进行验证，可以确保基因得到准确编辑。基因工程细胞系的常用验证方法有 Sanger 测序、二代测序和 qPCR，可以在基因组水平上验证编辑效率。Western blot 和质谱分析可在蛋白质组水平证实 敲除效率。在功能性研究中，经常使用免疫组化、免疫细胞化学和 FACS 进行验证。

CRISPR敲除细胞系的构建非常复杂

构建您自己的 CRISPR敲除细胞系需要冗长且细致的实验方案和大量人工操作，稍有疏忽就可能导致整个实验失败，并且直到最后才能知道结果。

CRISPR敲除细胞系构建实验方案中的每个步骤都有一些常见的失败点，其中一些步骤需要开展大量的分析。操作这些步骤的研究人员需要具备详细的细胞系知识，以及 CRISPR 经验和技能。在您的实验方案中对转染等步骤进行大量的优化，可以提高成功率。自动化和大规模 CRISPR 操作有助于整合这些优化3，但是，大多数实验室没有配备处理如此大量操作的设备。

研究人员构建 CRISPR敲除细胞系平均要花费 5 个月时间，大多数研究人员重复 3-4 次实验才能获得所需的基因敲除细胞系3。

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这些 CRISPR敲除细胞系已经过Sanger 测序并在多种情况下经 western blot 充分验证，在基因组和蛋白质组水平验证了基因的完全敲除。

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