图1（A-B）ALP染色及活性检测，（C-D）茜素红染色及定量

文献链接：

（3）Trap染色：抗酒石酸酸性磷酸酶（Trap）为破骨细胞的标志酶，为破骨细胞所特有，Trap染色后的破骨细胞呈现红色（图2）。

事发二

含有二氧化锰(MnO2)包覆成纤维细胞激活蛋白抑制剂(FAPi)的磷酸钙微球的复合水凝胶用于骨质疏松性的骨缺损修复

图2 Trap染色

文献链接：

02

基因、蛋白的表达

（1）q-PCR检测：可以进一步探究材料的促进细胞成骨分化能力，这是一种从基因水平评价细胞的相对mRNA含量来表示成骨分化程度的方法。主要有碱性磷酸酶(ALPL)、分泌型磷酸蛋白1(SPP1)、Runt相关转录因子2(Runx2)、骨γ-羧基谷氨酸蛋白(BGLAP)和I型胶原α1链(Col1a1)的表达。通过Western blotting检测不同处理组骨髓间充质干细胞成骨相关蛋白的表达（图片源于事发二）。

图3 复合水凝胶上BMSCs体外成骨的表征

（2）检测破骨细胞生成相关基因：其可进一步探讨复合水凝胶对BMMS破骨细胞分化的影响，主要有Fos原病基因(Fos)、活化T细胞核因子1(Nfatc1)、酸性磷酸酶5(Acp5)、基质金属蛋白肽酶9(Mmp9)、组织蛋白酶K(CTSK)的表达（图片源于事发二）。

图4 BMMS在复合水凝胶上破骨成骨过程中Fos、Nfatc1、Acp5和Mmp9的相关基因表达和蛋白表达的定量分析

（3）蛋白质组学及分子功能分析：水凝胶中含有与细胞迁移、粘附和血管生成功能显著相关的成分，蛋白质组学分析表明，水凝胶与“细胞外基质”呈显著正相关，而与“核成分”无关。分子功能分析表明，这些组分参与了胶原、整合素、钙离子、钙调蛋白和钙依赖蛋白的结合，有助于生物矿化并诱导细胞行为和生物矿化 。

事发三

骨膜基质衍生的水凝胶在骨愈合过程中的免疫调节和促进骨再生作用

图5 蛋白质组学及分子功能分析

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03

血管的生成

（1）成血管化：其是组织工程骨缺损修复的关键，且在新生的骨组织形成之前构建血供系统是极其重要的一环，已被认为是继细胞、支架和因子三大要素之后的又一重要因素。常见的就是构建组织工程血管化的有关细胞和相关因子，EFL在之前分享过

如何表征水凝胶的促血管生成能力

，这里不再为大家详细介绍，举两个典型的例子供大家参考。

事发四

人脐静脉内皮细胞（hUVECs）实验表明该水凝胶具有促血管生成作用

图6 水凝胶的促血管生成作用（血管化细胞）

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事发五

CD31（血小板-内皮细胞粘附分子）评估血管生成

图7 水凝胶的促血管生成作用（CD31）

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