细胞因子是由免疫细胞（如单核、巨噬细胞、T细胞、B细胞、NK细胞等）和某些非免疫细胞（内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等）经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。

细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。这些细胞因子的种类很多，包括肿瘤坏死因子—α(TNF-α)、白介素—1β(IL-1β)、白介素—6(IL-6)、转化生长因子—β(TGF-β)等。

研究细胞因子为临床上疾病的预防、诊断、机理研究以及治疗等奠定了良好的基础，应用前景非常广泛。

目前检测细胞因子的方法有很多，根据检测原理和手段的不同，检测技术大致可分为四类：免疫学方法、生物学方法、分子生物学方法及质谱法。

本篇内容我们就和大家一起来汇总一下10种方法的技术原理及方法特点：

炎症因子作为一种蛋白质抗原，可以特异性与其单克隆抗体结合，利用抗原抗体反应检测细胞因子，近年来发展比较快，其方法包括Western Blot法、酶联免疫吸附测定法、酶联免疫斑点技术、超敏电化学发光技术、Luminex液相芯片检测技术、Olink技术、Simoa技术。

Western Blot（WB），就是大家熟知的蛋白质印迹法、免疫印迹实验。是一种常规的蛋白分析技术，常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。WB实验的基本核心理念是抗原抗体的特异性反应，通过变性胶SDS-PAGE将不同分子量的蛋白质分离开，然后转移到固相载体硝酸纤维素薄膜（NC）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，再用脱脂牛奶作为封闭液进行封闭和一抗稀释液进行稀释。待目的蛋白和抗体充分结合后，用洗脱液洗脱掉多余未结合的一抗，加入带有标记的对应二抗，这样，目的蛋白+一抗+二抗形成一个复合物，加以化学发光液，有靶蛋白的位置就会产生荧光，利用胶片或者化学发光仪就可以显现靶蛋白的条带显现。

Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA），酶联免疫吸附测定法，是将抗原、抗体的免疫反应和酶的高效催化反应有机结合而发展起来的一种综合性技术。固定在载体表面的抗原或者抗体不会失活，仍然保留其免疫反应性。酶标记的抗体或者抗原既具有免疫学活性，还具有酶的催化活性。在实际检测时，首先将抗原或者抗体固定在固相载体上。然后加入检测对象，让待测物质与固相化物质结合，形成固相化的“抗原—抗体”复合物。再加入酶标记的抗体或者抗原，与固相化的复合物结合，形成酶标复合物。最后加入底物溶液，发生酶催化底物显色反应，根据颜色深浅进行定性或定量分析。

Enzyme Linked Immunospot Assay（ELISpot），酶联免疫斑点技术，细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。BCIP/NBT底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISpot酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。该技术可以在单细胞水平对抗体分泌细胞及细胞因子分泌细胞进行检测，能从20万-30万细胞中检岀1个分泌该蛋白的细胞。该方法关注的结果是分泌细胞的比率（等于阳性细胞数/总细胞数）。主要用于疫苗、细胞治疗、基因治疗等领域，是研究T细胞免疫原性反应的主要检测方法。

ELISpot通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下或通过仪器对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。而ELISA则通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。该方法的样本要求是活细胞，其中细胞存活率最好不低于80%，如果能达到90%以上更好。

Meso Scale Discovery（MSD）超敏电化学发光技术，基于石墨微孔板的电化学发光免疫分析是根据ELISA基本原理的升级，在板底通电从而激发标记物SULFO-TAG发光并由CCD Camera进行信号采集。主要基于超敏多因子电化学发光分析仪MESO Sector 600或Quickplex SQ 120。通过点阵技术，在96孔石墨电极板里可实现10个指标每孔的检测。也可在24孔板里定制实现100指标/孔的筛选检测。

该技术是结合微球和流式细胞仪的原理来检测蛋白的一种方法，核心是将聚丙乙烯微球或者磁性微球用荧光染料的方法进行编码，通过调节两种荧光染料的不同配比获得最多100种具有不同荧光光谱的微球，每种微球共价交联上针对特定抗原的捕获抗体。应用时，先将针对不同检测物的微球混合，加入待测样本后，靶分子与微球表面的捕获抗体特异结合，每个反应孔中可同时完成最多100种检测反应。上机时仪器通过两束激光分别识别微球的编码和微球上报告分子的荧光信号强度，荧光强度反应微球结合的靶标蛋白的含量，这一步用于定量。因此，利用微球技术，可以同时检测多个蛋白。

该平台是基于临近延伸分析（PEA）技术，通过一对特异性抗体结合识别靶蛋白，这对抗体分别偶联DNA寡核苷酸标记，当结合在同一蛋白上的两个抗体相互靠近时DNA寡核苷酸互补配对并结合DNA聚合酶进行扩增。最后，使用qPCR或二代测序技术定量DNA寡核苷酸，通过特异性的核苷酸序列信号来反应检测蛋白质的含量。

该技术（single molecule array，Simoa）是基于微阵列芯片的单分子免疫检测，是在毫米级芯片上雕刻（或浇筑）成千上万个微米级微井，每个微井体积约40 fl左右，随后将免疫复合物磁珠分配于微井中，再借助高分辨率荧光显微镜对荧光点进行计数，依据泊松分布理论，计算同时含珠子与荧光产物孔的数量/含珠子孔总数的比值，以此确定测试样品中的蛋白质浓度。

主要是检测细胞因子的基因表达水平，包括对其DNA的检测和mRNA表达水平的检测。对于表达低或者体内只能得到数量极少的细胞产生的细胞因子，因其含量太低，免疫学和生物学方法难以测定，常用的方法有Southern印迹、斑点印迹、PCR，原位杂交及原位PCR等，Northern印迹及RT-PCR。这里简要介绍常见细胞因子mRNA表达水平的检测。

即将RNA的反转录（reverse transcription ）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。细胞因子的mRNA寿命短且拷贝数低，因此难以在小量样本中进行检测。RT-PCR是一种能检测细胞内低丰度特异RNA的方法，其原理是首先以RNA为模板，在逆转录酶的催化下，合成与RNA互补的cDNA。然后已cDNA为模板，用PCR技术对靶序列进行扩展，使微量细胞因子的RNA经放大后检出。

该方法尤其适用于含量极少或容易降解的细胞因子，无视样本类型，只需要设计好相对性的扩增引物及探针。但易出现假阳性和假阴性，在实验中必须设严格的对照实验。且测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平，并且不容易对细胞因子表达水平进行定量。

即流式编码微球芯片技术，又称细胞因子微球检测技术，是用流式细胞仪对多重蛋白进行定量检测的方法，能够同时对样本中的多个指标进行定性、定量检测，可应用于细胞因子检测。目前CBA检测系统采用聚苯荧光编码微球（有磁性/非磁性）连结特定的捕获抗体，捕捉待测物，同时再加入待测物的荧光抗体，三者形成夹心复合物，通过流式细胞仪进行检测。

CBA法的优点是同时可以进行多参数检测，快速并且信息量大，其优势体现在能够同时对单个样本进行多种检测，所需样本量少、灵敏度高、稳定性好等。

以上我们介绍了2种基于流式细胞术技术的细胞因子检测方法，差异对比见下表：

即用电场和磁场将运动的离子（带电荷的原子、分子或分子碎片）按它们的质荷比分离后进行检测的方法。因为质谱仪器的种类多，应用范围广，其检测灵敏度极高，但目前主要用于细胞因子检测的方法有待进一步开发，市面上主要存在靶向蛋白质组学（PRM）方法和非靶向蛋白质组学方法，PRM检测法最多一次可检测50种蛋白质进行绝对/相对定量，非靶向蛋白质组学方法最多一次可检测多达数千种蛋白质进行绝对/相对定量，但重复性稍差，要严格控制操作条件。此外，生物样品的前处理方法跟检测结果的准确性息息相关。

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