SPR竞争性结合实验案例分享(一):定性竞争结合实验 |
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使用Biacore设备独有的A-B-A、Dual injection等进样模式可以快速稳定进行竞争性实验分析;无论是定性类、还是定量类实验,均可高效稳定进行,Biacore设备支持Sample Mix、Buffer Mix及A-B-A 三种实验模式。 Biacore 用于竞争性分析的三种模式以抗原表位分析为例展示Dual injection模式,第一个抗体固定在芯片上案例一:2021年由中南大学湘雅三医院吕奔教授团队在Immunity上以“Heparin prevents caspase-11-dependent septic lethality independent of anticoagulant properties”为题,阐述了肝素在脓毒症中能通过抑制Caspase-11的活化防止脏器损伤、DIC发生和死亡,为今后脓毒症的防治提供了新的思路。 肝素(Heparin, Hep)是哺乳动物内源性的多糖分子,也是临床上常用的抗凝药物。吕奔教授团队在筛选HMGB1-Caspase-11途径抑制剂 的过程中,发现了肝素能高效且有选择性的抑制Caspase-11的活化。在内毒素血症和脓毒症(结肠结扎穿孔模型)中,小剂量肝素的应用能有效阻断Caspase-11介导的免疫反应、脏器损伤和死亡,而对Caspase-11非依赖的炎症因子(如TNF, IL-6等)的释放无明显影响。 通过使用化学修饰后失去抗凝作用的无抗凝活性肝素(non-anticoagulant heparin, NAH), 该团队在研究中进一步分离了肝素的抗凝作用和抗炎作用。与肝素(Hep)相比,增大无抗凝活性肝素(NAH)的用量对凝血指标APTT与TT没有明显影响)。但NAH在内毒素血症和脓毒症模型中能同样高效的阻断Caspase-11介导的免疫反应、脏器损伤、DIC形成和死亡。 在随后的机制探讨过程中,该团队发现:肝素不是caspase-11的直接抑制剂,却能有效防止内毒素(LPS)进入细胞浆。过去的研究发现高迁移率蛋白-1(HMGB1)或细菌外膜囊泡(OMVs)能将LPS高效转运至细胞内,从而导致caspase-11的过度活化。HMGB1或OMVs介导的LPS胞浆内转运能被小剂量的肝素(Hep)或非抗凝活性肝素(NAH)阻断。邻位连接实验(PLA)显示:肝素(Hep)或非抗凝活性肝素(NAH)能防止caspase-11对LPS的识别,再次验证了肝素对LPS胞浆内转运的抑制作用。 该团队在细胞和分子水平探讨了肝素抑制LPS胞浆内转运的机制,发现肝素(Hep)或非抗凝活性肝素(NAH)主要通过肝素酶(Heparanase)和高迁移率蛋白-1(HMGB1)两个作用靶标来阻断LPS的胞浆内转运(下图)。肝素酶在炎症反应中表达上调,能降解细胞膜外侧的糖萼(又称“多糖包被”)。糖萼的降解能使HMGB1或细菌外膜囊泡(OMVs)更高效的向胞浆内转运LPS,使得caspase-11的活化显著增强。而肝素(Hep)或非抗凝活性肝素(NAH)恰能有效的抑制肝素酶的活性,从而阻止糖萼的降解(下图)。此外,肝素(Hep)或非抗凝活性肝素(NAH)还能与HMGB1高亲和力的结合,并竞争性的抑制HMGB1与LPS的相互作用。 肝素抑制LPS胞浆内转运的分子机制该团队利用surface plasmon resonance (SPR)技术验证了肝素直接抑制HMGB1与LPS的结合。首先作者通过SPR技术验证了肝素和NAH与HMGB1均有很强的亲和力,亲和力分别5.59*10-6,2.27*10-4.作者又通过SPR技术进一步验证了肝素和NAH均能抑制HMGB1与LPS的结合。 (A) Recombinant HMGB1 proteins were immobilized to the chips. The binding between HMGB1 and heparin (25, 50, 100, 200 μM, from the bottom to top) or NAH (25, 50, 100, 200 μM, form the bottom to top) was assessed by surface plasmon resonance. (C) Recombinant HMGB1 proteins were immobilized to the chips. The binding between LPS and HMGB1 in the presence or not of heparin (up panel) or NAH (bottom panel) was assessed by surface plasmon resonance. 案例二:北京大学王月丹与初明教授团队围绕新冠病毒的防治工作筛选到了一种天然产物Tuftsin,相关成果于2022年发表在Frontiers in Molecular Biosciences杂志上以Tuftsin: A Natural Molecule Against SARS-CoV-2 Infection发表。Tuftsin是脾脏产生的一段生理活性肽,其基本功能是刺激巨噬细胞和粒细胞,提高促吞噬的能力;可以通过增强效应细胞的细胞毒功能杀伤肿瘤细胞等,在抗感染方面具有不可替代的作用。 通过多轮的化药库筛选、分子对接等实验,课题组筛选到Tuftsin分子。使用Biacore体外验证了Tuftsin与ACE2分子及抑制的效应分子NRP1的亲和力,结果表明Tuftsin能特异性识别并结合ACE2分子。通过基于SPR的竞争结合实验验证了Tuftsin能有效抑制 SARS-CoV-2 S1蛋白与ACE2的结合。 首先研究人员利用Biacore测定了Tuftsin与ACE2及NRP1的亲和力,亲和力分别为460 μM和10.65 μM。然后又利用Biacore进行了竞争结合实验研究了Tuftsin能否影响是蛋白与ACE2的结合,将S1蛋白固定在CM5芯片上,设置ACE2 (5 nM) 对照组及Tuftsin+ACE2(ACE2为固定浓度,5 nM; Tuftsin设置9/156/625 μM)实验组;结果表明,Tuftsin浓度越高,结合响应值 (Response, RU) 越低,即证明Tuftsin可有效阻断/抑制S1与ACE2的识别与结合。 测定 tuftsin与ACE2及NRP1的亲和力Tuftsin 抑制 SARS-CoV-2 S1 与 ACE2结合案例三:首都医科大学和北京中医药大学的科研团队发表的Identifcation of berberine as a direct thrombin inhibitor from traditional Chinese medicine through structural, functional and binding studies. Sci. Rep一文在传统中药中筛选特异性抑制凝血酶的小分子抑制剂,最终得到的黄连素 (Berberine,BBR) 被证明可以直接结合凝血酶从而抑制其诱导的血小板聚集。凝血酶 (Thrombin) 是血液凝固级联反应中的关键酶,被认为是多种心血管疾病中重要的药物靶点。 研究人员首先在Biacore上证明了Berberine可以直接与凝血酶结合,两者的亲和力为16.39 μM(下图 A/B),比已上市的抗凝血药阿加曲班 (Argatroban) 的亲和力更高(下图 C/D,KD=53.78 μM)。 Berberine/ Argatroban与Thrombin的结合然后研究人员利用Biacore特有的A-B-A进样设计竞争实验,证明Berberine与Argatroban结合在Thrombin相同的位点上。A-B-A的进样方式简化了竞争实验的设置,允许两种不同的溶液按照溶液A/溶液B/溶液A的顺序在同一个循环内进样,由于竞争样品无需再溶解在运行缓冲液里,大大减少了竞争样品的消耗量,非常适用于药物的竞争分析。 ABA进样设置Berberine和Argatroban的竞争实验从下图的实验结果中可以看到:Berberine不存在时,Argatroban与Thrombin有明显的结合信号(下图,red line);而在300 μM Berberine存在的情况下(A-B-A样品设置参照上图),Argatroban与Thrombin的结合响应值明显降低(下图,blue line)。证明Berberine在Thrombin上的结合位点与Argatroban是一样的。综合后续的血小板凝集实验,这一研究说明Berberine是潜在的安全有效的凝血酶抑制药物。 Berberine和Argatroban竞争实验结合 |
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