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基因测序作为一种重要的实验技术，在生物学研究中具有广泛的应用。1977年，Sanger发明了具有里程碑意义的末端终止测序法，凭借简便、快速等特点，迅速成为DNA测序的主流。高通量测序，则对传统Sanger测序产生了革命性变革，一次运行即可同时得到几十万到几百万条核酸分子序列，亦称第二代测序。第三代测序技术也称单分子测序技术，在保证高通量的基础上对单条序列从头测序，能够直接得到长度在数万个碱基的核酸序列信息。第二代测序在疾病诊断和癌症精准治疗中扮演了重要角色。随着高通量测序技术的发展，二代测序可帮助临床医生在诊疗中提升诊断水平，做出合理决策，为住院患者带来福音。在精准医疗分子诊断实验室中，建库（文库构建）是整个二代测序流程中的重点一环。 所谓建库，即把基因组序列随机片段化成小片段，再构建成与测序平台匹配的长度和结构的过程。 文库构建的好与坏，直接影响着实验结果的准确性。如果文库上机测序的浓度很低，样本在FlowCell上扩增所形成的DNA样本簇就会很少，测序数据量也会随之减少，从而导致测序实验失败。所以，建库是二代测序过程中的关键步骤之一，直接影响测序质量。 那么，在实验室流程操作方面，影响基因文库浓度低的原因有哪些？其实，原因一直贯穿于建库实验始末，每一环节的不规范操作及异常情况都会对基因文库的浓度造成影响。文库构建分为实验前准备、基因组DNA片段化、末端修复、加A、接头连接、磁珠纯化、PCR扩增七个步骤。二代测序流程01 在实验开始之前，需要提前将磁珠置于室温平衡30分钟，以保持磁珠活力，在开始使用之前要充分震荡、混匀。因为在未使用时，磁珠是与溶液上下分层，磁珠如果未完全混匀或未室温平衡则会导致建库浓度偏低。02 基因组DNA片段化，目前主要为酶打断和超声打断两种方法。但酶打断方法具有一定的偏好性，超声打断方法仍是目前主流打断方式，打断时间过短或过长均会影响建库浓度。DNA超声打断仪 03 末端修复环节中，使用的修复试剂的剂量一定要准确，无论多加、少加、漏加都会导致DNA粘性末端变为平末端的修复程度差，接头连接出现问题，导致建库浓度偏低。04 加A，与接头T互补配对，增加接头连接效率。如果没有加A，接头连接大大减少，直接影响实验结果。05 接头连接，与芯片配对发生成簇反应。如果没有添加接头，或接头的量不足，均会导致建库浓度偏低，影响实验结果。如果这一步的index没有添加或者添加剂量很少，将会导致建库的浓度偏低或测序时寻找不到标签号而导致实验失败。06 磁珠纯化，用于片段选择。将模板DNA转移到磁珠中，运用XP磁珠片段选择的功能将目的基因片段筛选出来。根据磁珠优先吸附大片段原理，使用不同体积磁珠，第一步磁珠纯化去除大片段，第二步磁珠纯化去除小片段，从而得到目标片段长度DNA。如果样本经过琼脂糖凝胶电泳扩增出的DNA条带含有大片段，就需要进行磁珠的片段选择。这一步筛选过程十分重要，不可以转移到大片段磁珠，否则后续实验将无法去除大片段，影响测序结果判读。 基因组DNA凝胶电泳成像 目标DNA凝胶电泳成像纯化操作时，应使用70％-80％的酒精洗涤，浓度过高或过低均会影响到建库浓度。酒精需要现配现用，不可使用常温储存的酒精，防止酒精挥发后浓度发生改变，进而影响建库浓度。07 PCR扩增，通过接头引物扩增富集文库，避免PCR试剂的多加、漏加，如果操作不当将导致建库实验失败。PCR扩增仪除了文库浓度影响上机测序之外，还包括文库转化率、文库复杂度、均一性和准确性。文库转化率 文库转化率是评估文库质量的重要指标，指文库中两端都连上接头的目的片段占总片段数的比值。只有双端都连接上接头的目的片段才能在FlowCell上通过桥式扩增形成簇，最终完成测序过程。而不是双端都连上接头的目的片段最终都不能完成测序过程，视为无效片段，如果这样的片段过多直接影响最终输出的数据过少，就会导致测序失败。文库复杂度 文库复杂度是指文库中DNA序列的复杂程度。一定的文库复杂度对后期测序数据分析尤为重要，复杂度高的文库测序得到的重复数据少，可带来更多有意义的信息，反之，低复杂度的文库在信号读取时往往易产生低质量的测序数据。文库复杂度与样本质量和文库扩增时的循环数有关。当样本质量越差，或文库扩增循环数越多时，文库中不能带来有意义信息的重复读数就会增多，则文库的复杂度越低。均一性 均一性指的是读取数据在基因组或目标区域的分布均一程度。一般认为覆盖越均匀，达到特定深度所需的测序数据越少，覆盖均一性很多时候取决于GC含量，通过对低/高GC区域的局部探针浓度调整可以优化Panel的覆盖偏好。准确性 准确性指实验结果的准确性。文库构建的准确性越高，对变异报告的信任程度就越高。实验过程中的质控品，也有助于评估NGS流程的准确性。比如说，在实验流程中加入的阴性对照、阳性对照、空白对照都是对整个NGS实验准确性的一个判断。该如何把控基因文库的质量呢？文库在上机之前都会进行质量检测，质量检测合格的文库才会上机测序。一般先用Qubit进行文库定量。然后使用2100生物分析仪进行文库片段分析，并且以P5、P7为引物进行QPCR定量来质检文库。二代测序作为一项突破性技术，使分子诊断迎来了新的机遇，同时也面临着许多挑战。但是，在未来较长时间内仍为主流的测序技术，并且在临床应用发展方向上具有广阔空间。大数据分析能力将继续发展以满足精准医学不断增长的需求，并成为基因测序企业的核心竞争力。来源：MIR医学仪器与试剂 声明：本平台注明来源的稿件均为转载，仅用于分享，不代表平台立场，如涉及版权等问题，请尽快联系我们，我们第一时间更正，谢谢！ |
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