粘细菌资源挖掘与多相分类研究进展

粘细菌(Myxobacteria)是一类位于δ变形菌纲(Deltaproteobacteria)粘球菌目(Myxococcales)的革兰氏阴性棒状杆菌[1]，其基因组很大，一般为9−15 Mb。粘细菌具有复杂社会学特征，如能够进行滑行运动、形成颜色鲜艳的子实体和抗逆性粘孢子。广泛捕食各类细菌和真菌，被认为是高等原核生物[2]。粘细菌这些复杂行为为研究细菌多细胞行为和进化过程提供了丰富的素材{[3]。另外，粘细菌是仅次于放线菌和芽孢杆菌的第三大次级代谢产物产生菌，目前已经在粘细菌发酵产物中分离和鉴定出500多种具有新型骨架的天然产物，结构衍生物的数目高达2 000种以上[3]。因此，粘细菌具有重要的研究和应用价值。

然而，由于生长缓慢和密度依赖性生长等特点，粘细菌很难分离和纯化，截至目前仍有99%以上的资源未被获取[4]。此外，粘细菌具有复杂的生活周期和特殊的脂肪酸类型，与常规菌种鉴定存在一定差异[5-6]。目前发现很多粘细菌新资源，由于在表型描述及脂肪酸分析等方面比较复杂，导致一些菌株没有被进一步鉴定及命名，粘细菌的多相分类研究进展缓慢。本综述对粘细菌资源挖掘和多相分类研究进展进行详细阐述，并对未来发展趋势进行展望，以期为相关研究人员提供参考。

由于资源挖掘困难，截至目前，粘细菌仅分为1个目3个亚目10个科30个属78个物种(图 1)[4]。第一大亚目为孢囊杆菌亚目(Cystobacterineae)，其中粘球菌科(Myxococcaceae)中的粘球菌属(Myxococcus)和珊瑚球菌属(Corallococcus)生长较快，容易形成子实体被分离到[7]。第二大亚目为堆囊菌亚目(Sorangiineae)，其中堆囊菌属(Sorangium)是一类能产生具有独特结构和作用模式的天然产物产生菌，纤维堆囊菌(Sorangium cellulosum)中分离到的次级代谢产物占粘细菌总次级代谢产物的48.4%[8]。第三大亚目为小囊菌亚目(Nannocystineae)，除其中Kofleria flava分离自陆地环境之外，其他小囊菌亚目为嗜盐和耐盐粘细菌，均分离自海洋环境。在另外两大亚目中，目前仅孢囊杆菌亚目的Myxococcus fulvus HW-1分离自海洋生境，耐盐度高达3%[9]，其他菌株均来自陆生或淡水生境，耐盐度一般不超过1%[10]。根据食性不同，粘细菌分为两大类，绝大多数为噬细菌类群，仅堆囊菌亚目中的堆囊菌属和Byssovorax为噬纤维素类群[11]。在粘细菌类群中，目前仅发现一个(兼性)厌氧粘球菌属和种Anaeromyxobacter dehalogenans[12]，在水体和污泥等氧气含量低的生境中含量丰富，也有报道指出在噬纤维素类群中可能存在(兼性)厌氧粘细菌[4]。随着粘细菌新资源不断被挖掘，有3株菌(Vulgatibacter incomptus、Labilithrix luteola和Simulacricoccus ruber)被发现既不能噬细菌也不能水解纤维素，隶属于第三大粘细菌类群[13-14]。

粘细菌能产生结构独特和生物活性多样的次级代谢产物，被认为是聚酮类、非核糖体肽及其杂合化合物的潜在来源，这些化合物具有抵抗细菌、真菌、紫外及细胞毒性等多种作用[10, 15]。已经上市的抗癌药物伊沙匹隆Ixabepilone (IXEMPRA)就是由纤维堆囊菌分离的埃博霉素B研制而成[16]。然而，由于粘细菌中很多次级代谢产物基因簇表达量低或基因沉默，导致有些代谢产物分离不到，需要结合多种方法进行分离。次级代谢产物的分离主要基于以生物活性、培养、代谢及基因组学为导向[17-19]，结合不同微生物共培养、不同生活史阶段代谢组的变化及化学诱导剂的影响，以最大限度地获取其资源。

根据噬细菌和噬纤维两大类群的食性特征，目前粘细菌的分离方法主要包括兔粪诱导法、酵母诱导法、大肠杆菌诱导法(A)和纤维滤纸法(B)[20](图 2)等。其中，大肠杆菌诱导法是在水琼脂培养基上使用大肠杆菌作为粘细菌诱导物；纤维滤纸法是在培养基(KNO3 1 g/L，K2HPO4·2H2O 1 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，CaCl2·H2O 1 g/L，FeCl3·6H2O 0.2 g/L)上，使用灭菌滤纸作为唯一碳源；通过大肠杆菌或纤维滤纸等诱导粘细菌子实体形成，将观察到的子实体挑到不同纯化培养基中，置于30 ℃培养箱进行培养[20-21]。分离到的粘细菌种类与其生存环境有很大相关性，一些常见类群如珊瑚球菌、粘球菌及原囊菌属(Archangium)等普遍存在于不同生境中，使用多种方法都能分离到[22-25]。湿地底泥样品中粘细菌类群明显多于其他样地，用大肠杆菌能够诱导出不同种类粘细菌子实体[26]。由于不同种属粘细菌子实体形成时间不同，一般分离平板需要持续观察1−2个月时间。目前常用的纯化方法包括转接法、划线法、挖取底部菌落法、水琼脂纯化法、抗生素纯化法及加热纯化法等[20]，纯化培养基通常采用VY/2和MD1培养基[27]。将纯化的菌株用斜面、甘油及冻干等方法进行保藏。

目前科学家已在世界各地的多种生境中分离到粘细菌，如温带、热带雨林、北极苔原、沙漠、酸性沼泽[7]，以及海洋和其他盐碱环境[22, 28]、堆肥[29]或者食草动物粪便[30]等。Dawid[30]于2000年基于文献中提供的数据，以及他自己对来自64个国家和所有大洲的近1 400份土壤样本提供的数据，分析了粘细菌的全球分布情况；研究发现，来自地中海型冬季雨林气候、永久湿润雨林气候和热带半沙漠气候的土壤中，粘细菌物种的平均数量异常高；然而，在寒温带针叶林和泥炭藓针叶林的中温带气候的土壤中粘细菌物种平均数量较低。目前，国际上Mohr等[4, 7, 29]从不同生境中分离到多种粘细菌资源，并发现许多不同食性及子实体形态的新类群。在国内，李越中等[20]于2000年左右从我国20多个省市采集的样品中分离到几百株粘细菌，隶属于10个不同属；Zhang等[22]采用常规方法从新疆盐碱地中分离到58株粘细菌，隶属于6个不同属，并发现有些粘细菌耐盐度超过2%，打破了对陆地粘细菌耐盐度一般不超过1%的认识；他们还利用大肠杆菌诱导法和纤维滤纸法从越南原始森林土壤中分离纯化到32株粘细菌，隶属于6个不同属[23]；赵智颖等[24]利用不同于大肠杆菌的诱导菌(Achromobacter sp.)从华南植物园和南岭国家森林公园采集的药用植物根系土壤中分离获得50株粘细菌，隶属于3个科7个属；李百元等[25]采用多种不同种属的细菌作为诱导菌株，从新疆阿克苏盐碱地中分离55株粘细菌，隶属于5个不同属；此外，张鲜姣等[26]从广东不同地区湿地底泥中分离到多株粘细菌新类群；Li等[31]采用变性梯度凝胶电泳法发现土壤中丰富的粘细菌类群；蚁硕星等[32]通过添加土壤浸提液，使用不同种类诱导菌及改变诱导菌接种方式等改进措施，发现新方法比传统粘细菌分离方法可以获取更多粘细菌类群。

由于缺乏合适的分离和纯化方法，环境中仍有99%以上的粘细菌不能被获取[4]，这极大地限制了粘细菌资源开发与应用。影响粘细菌资源挖掘的主要因素有：(1) 由于缺乏合适诱导物或粘细菌不以子实体形态存在，导致环境中大量粘细菌不能诱导出来。在2018年，Garcia等[13]首次发现了不以子实体形态存在的粘细菌，他们从德国萨尔布吕的新鲜土壤样品中分离到一株Simulacricoccus ruber，隶属于粘球菌科；其不能形成子实体，以粘孢子形态存在，是一株微厌氧粘细菌。(2) 诱导出来的子实体由于缺乏合适的培养条件，在常用VY/2或MD1培养基上不能生长，导致新资源获取失败。(3) 子实体形成缓慢，在分离过程中，很多后期形成的子实体容易被真菌覆盖，从而不能被获取。(4) 粘细菌极易死亡，分离纯化的一些罕见难培养粘细菌，使用常规的甘油、液氮和冻干3种保藏方法仍然很难长时间保藏，造成珍贵的粘细菌资源丢失。

随着生物信息学时代的到来，高通量测序手段可以调查不同生境中粘细菌的多样性及影响其分布的因素，并发现了大量未培养粘细菌资源，对粘细菌资源挖掘具有一定的指示作用[33-35]。最初粘细菌一直被认为是陆生细菌，随着嗜盐和耐盐粘细菌在沿海地区被分离，并且在形态和多种特征上与陆生粘细菌不同，逐渐证实了海洋粘细菌的存在[36-37]；但淡水粘细菌一直被认为是由陆地粘细菌的粘孢子或含粘孢子的子实体被冲进河流或湖泊中萌发而来[33]。直到2012年，Li等[33]用454焦磷测酸测序方法调查了淡水湖中粘细菌的群落，结果显示粘细菌是淡水环境中的主要类群之一。Wang等[34]发现在活性污泥样品中粘细菌是整个微生物群落的主要成员之一，序列占总序列数的0.9%−9.5%。令人意外的是，Grice等[35]在患有特应性皮炎的儿童皮肤上也发现大量粘细菌，这些粘细菌的生物学意义尚未被很好地研究。不同生境中粘细菌的丰度和多样性不同，在长期的环境选择下，形成独有的特征以适应相应的环境，例如盐碱地或者海洋生境中分离到的粘细菌具有较高的耐盐性[9-10]。Zhou等[38]发现粘细菌群落丰度与土壤pH值、碳氮比和温度有关。此外，粘细菌作为一类土壤微生物捕食菌，广泛捕食其他细菌和真菌，影响微生物动态平衡[39]。Wang等[40]也发现粘细菌与土壤pH和细菌多样性有关。由此可见，环境中的生物因素和非生物因素对粘细菌分布均有影响。

综上所述，粘细菌的分布范围广泛，从一些极端环境中有望获得新的类群。另外，根据不同生境的生理特性，可以对粘细菌的分离方法进行改进。例如分离盐碱地或海洋粘细菌时，可以使用高盐培养基。堆囊菌属在酸性土壤中含量丰富，可以使用pH值较低的培养基进行分离[40]。粘细菌的常规培养温度为30 ℃，有些粘细菌在低温或高温条件下才能存活，例如Haliangium tepidum最适培养温度为37−40 ℃[24]，可以尝试不同温度进行分离培养。此外，粘细菌作为一类广泛捕食菌，可以选用不同细菌类型对粘细菌子实体进行诱导[25, 32]。针对诱导出来的子实体在平板上不能生长的问题，可以将诱导菌制成相应的分离平板，对分离培养基进行改进，以保证诱导出来的子实体均能存活。目前有关不同生境中的生物因素，如细菌、真菌或不同植物类型对粘细菌多样性及丰度影响的相关报道还极度缺乏，通过调查影响粘细菌分布的环境因子，分析粘细菌对某一类生物因子或非生物因子是否具有偏好性，能够为粘细菌资源挖掘提供一定的指导意义。总之，通过不断尝试新的方法，结合组学和生物信息学相关技术手段，有望在不久的将来获取更多宝贵的粘细菌资源。

德国亥姆霍兹药物科学研究所Garcia等[5, 41-42]对粘细菌资源与鉴定研究较多。图 3为目前已知粘细菌类群，包含66个物种，另外有3株菌Corallococcus sp. Z5C101001、Corallococcus sp. H22C18031201和Archangium sp. 12S042801隶属于粘球菌属，是Wang等前期从鼎湖山森林土壤中分离到的潜在新物种，有待后期进行多相分类研究[40]。此外，Livingstone等[43]使用多相分类方法，包括脂肪酸甲酯分析、底物利用及糖同化实验、不同菌株捕食范围、抗性范围及表型特点，结合比较基因组学分析鉴定了8株珊瑚球菌属新物种。Chambers等[44]通过比较基因组及泛基因组分析粘球菌科菌株，并鉴定了3株粘球菌和2株匣状球菌新物种，同时将Myxococcus virescens与Myxococcus xanthus合并为一个物种。目前可培养粘细菌的物种数为78株，这些菌株为新型次级代谢产物及抗菌素的挖掘提供了丰富的资源。

粘细菌的多相分类研究流程与细菌类似，首先根据16S rRNA基因序列相似度 < 98.7%，初步判定是一个新物种，之后通过系统发育树构建、表型分析、化学分类及基因组平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity，ANI)和数字DNA杂交值(Digital DNA-DNA Hybridization，dDDH)进行比较分析。对于16S rRNA基因序列相似度 > 98.7%的菌株，若基因组ANI值< 95%和dDDH值< 70%，也可以初步确定为一个新物种[45]。粘细菌与细菌多相分类研究也存在一定的差异：(1) 由于粘细菌的复杂生活史，通常能形成不同形态子实体和抗逆性粘孢子，所以在表型研究方面，粘细菌要比其他细菌的描述更细致[41-42]。(2) 粘细菌含有很多不饱和脂肪酸类型，某些类型用常规的MIDI系统无法鉴定到，需要使用特定的GC-MS方法[5, 46]。(3) 由于粘细菌很难培养，生理生化特征鉴定不能使用常规的API试剂盒，人为配制各种培养基加大了鉴定的周期及工作量[41-42]。(4) 粘细菌能产生丰富的次级代谢产物，是新药研发的重要资源。因此，不同抗生素类型是鉴定粘细菌的重要指标之一[41-42]。

根据NCBI数据库显示，许多16S rRNA基因序列相似度低的菌株隶属于粘球菌目，可能属于新科、新属或新种；但是这些菌株没有在International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM)或者Antonie van Leeuwenhoek等分类学杂志上被有效发表，导致大量可培养粘细菌新资源未被定名及确定其分类地位。早在2010年，Garcia等[47]对101株粘细菌的16S rRNA基因序列进行系统发育分析，证实了3个亚目的存在，并且发现了9个新的分类单元，可能属于新科水平。Liu等[48]从公共数据库中收集4 997份粘细菌的16S rRNA基因序列，通过人为划分基因序列相似度大小，确定其分类地位；结果显示4 997份粘细菌序列可以被归为20个亚目58个科445个属998个物种，存在大量新的分类单元。此外，随着分类学知识的逐渐完善，之前鉴定的某些粘细菌分类地位存在紊乱现象。综上原因，粘细菌的分类学研究严重滞后于其他类群，目前可培养粘细菌资源未得到充分反映，有必要开展相关研究。

粘细菌三大亚目在细胞形态、粘孢子发育、菌落结构、脂肪酸和类胡萝卜素类型以及粘液的化学成分等方面均存在差异。不同科、属和物种中，粘细菌子实体结构和粘孢子形状存在很大差别。刚果红可以将孢囊杆菌亚目染成深紫罗兰色，而堆囊菌亚目和小囊菌亚目不能被染色，因此，刚果红染色被作为鉴定粘细菌不同亚目的重要指标之一[49]。此外，粘细菌也有一些共有特征，如一般最适生长温度为30 ℃，pH呈中性或偏碱性，NaCl耐受度不超过1%，只有耐盐或嗜盐粘细菌可以耐受2%−3%甚至更高浓度的NaCl[9-10]。粘细菌具有丰富的水解酶和抗生素活性。粘孢子一般呈圆形或椭圆形，在光学显微镜下能看到粘孢子周围发荧光[41-42]。三大亚目主要特征如下[27]：

孢囊杆菌亚目主要特征：细长棒状营养细胞，末端呈锥形、雪茄形、船形或针形。菌膜或粘液能被刚果红染呈深紫罗兰色，但最新报道的粘球菌科中Simulacricoccus ruber[13]刚果红染色呈阴性，更新了人们对孢囊杆菌亚目的认识。不同种属子实体形态不同，粘球菌属呈驼峰到球形子实体，珊瑚球菌属呈珊瑚喇叭状子实体，软骨霉状菌属和标桩菌属像树状子实体。粘孢子大多有孢子囊，但粘球菌属和珊瑚球菌属没有，而与其16S rRNA基因序列相近且系统发育树位于相邻位置的Pyxidicoccus fallax具有孢子囊，从而将Pyxidicoccus fallax鉴定为一个新属。除Stigmatella外，其他种属主要包含支链脂肪酸，其中2, 3-羟基脂肪酸为主要脂肪酸。除Vulgatibacter incomptus和Simulacricoccus ruber之外，所有孢囊杆菌亚目均为嗜细菌类群。

堆囊菌亚目主要特征：营养细胞呈圆柱状，有些呈方形，末端普遍呈圆形；部分菌种有嗜琼脂特性，黏液和菌体不能被刚果红染色；它们的表面结构不太明显，虽然可能产生径向脉、环状脊和扇形构造；粘孢子与营养细胞在形状上只有细微的差别，无包膜或只有一层很薄的包膜；粘孢子发荧光；主要脂肪酸类型为直链脂肪酸，含有少量的支链脂肪酸，而羟基脂肪酸则完全不存在[27]。堆囊菌亚目中堆囊菌属和Byssovorax为嗜纤维类群，而Labilithrix luteola既不能嗜纤维也不能噬细菌，其他菌属均为嗜细菌类群[14]。

小囊菌亚目主要特征：一般分为2种类型，一种是没有黏液层的菌膜，在某些培养基上具有嗜琼脂特性，使培养平板变成类似海绵状的物质，营养细胞呈短棒状，子实体具有小到中等大小的孢子囊，单独或聚合；另一种类型，营养细胞呈末端圆形的细杆状，类似于堆囊菌亚目，长4−6 μm和宽0.6−0.7 μm，有厚的菌膜和明显的分枝静脉，类似于孢囊杆菌属，子实体形态未知。小囊菌亚目均为嗜细菌类群。

粘细菌能够产生很多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid，PUFAs)，其中Omega-3 PUFAs，特别是二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)和二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic，DHA)对医药和食品行业起重要作用，这些脂肪酸通常可作为食品、奶制品和药品添加剂[50]。不同种属粘细菌的脂肪酸类型和含量差异很大，常作为鉴定不同类群的重要指标之一。粘细菌中有些脂肪酸类型，特别是主要脂肪酸C17:1 2-OH用MIDI系统无法识别[5]，需要使用粘细菌特定的气相色谱-质谱(GC-MS)方法进行鉴定[46]。

在粘球菌科中，iso-C15:0是主要脂肪酸，含量占20%−60%；直链C16:1 ω5c是第二大脂肪酸类型，含量占7%−19%，但其在珊瑚球菌属中含量很低(不足1%)；iso-C17:0 2-OH是珊瑚球菌属的主要脂肪酸类型，含量约占20%−30%，而在其他种属中含量不足4%；除个别脂肪酸分类地位紊乱外，C16:1 ω5c、iso-C15:0和iso-C17:0也是原囊菌属和孢囊杆菌属的主要脂肪酸类型；在小囊菌亚目中，iso-C16:0和iso-C16:1是主要脂肪酸类型，大量的iso-C17:0也在其中被发现，但不同种属之间存在一定的差异；堆囊菌亚目中直链脂肪酸含量大于支链脂肪酸，直链C16:1 ω7c是最主要脂肪酸；C16:1 ω5c是第二大脂肪酸，但此脂肪酸在堆囊菌属中不存在，在堆囊菌属中含有较高的C16:0类型[6]。

随着全球新型冠状病毒疫情的暴发和多种病原细菌的不断出现，目前迫切需要新型抗生素用于新药研发。粘细菌作为一类重要的抗生素产生菌，有巨大的研究价值。Hoffmann等[17]调查了2 300份粘细菌序列，并解析了不同种属粘细菌中次级代谢产物类型，发现粘细菌分类地位与不同次级代谢产物家族之间具有相关性，并证明从新属中比同一属不同菌株中发现新型次级代谢产物的概率更大。将粘细菌资源多样性与其次级代谢产物多样性联系起来，可为天然产物挖掘提供保障。然而，由于获取的粘细菌资源有限，系统发育分类研究严重滞后，可培养粘细菌资源没有得到充分反映，环境中大量未培养粘细菌无法获得，从而使宝贵的粘细菌没有被人类充分认识和利用。因此，需要不断尝试粘细菌资源挖掘和多相分类研究新方法，以获取更多宝贵的新资源。

当前，基于全基因组的系统发育分析方法逐渐被应用到细菌的多相分类研究中，并且构建全基因组系统发育树更能准确展现细菌之间的分类地位。Liu等[51]利用基因组分析揭示了海源菌科(Idiomarinaceae)的分类及其多样性，将海源菌科重新归类为海源菌属(Idiomarina)、假海源菌属(Pseudidiomarina)和别样海源菌属(Aliidiomarina)。他们还利用全基因组序列分析了蜡样芽孢杆菌的分类地位，根据Genome BLAST Distance Phylogeny (GBDP)将224株蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌群划分为3簇，其中包含11个已知物种，有部分物种被合并一起，并有19−20个潜在新物种[52]。Hördt等[53]通过收集1 000多株α-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)的基因组序列，利用系统发育分类原则，从基因组数据中推断出不同菌株系统发育关系，纠正了一些科、属和种等有问题的分类单元的分类地位。由于粘细菌传统分类方法复杂且工作量大，大量粘细菌新资源有待鉴定，有望将全基因组分析方法应用到粘细菌的多相分类研究中，可以规避鉴定过程中存在的问题，纠正错误的分类单元，将有助于推动粘细菌的多相分类研究。

组学和生物信息学时代的到来及各种新兴技术的不断涌现，将为研究全世界不同环境中粘细菌的多样性和生态分布提供新的视角，有助于分离未培养粘细菌和活性代谢产物。随着粘细菌越来越多新的特征被发现，并且发现无子实体的细胞形态，出现了除噬细菌和噬纤维类群之外的第三大粘细菌类群。只有不断创新研究方法，结合新兴技术，才能获取更多粘细菌资源及逐渐完善对粘细菌的认识。这些宝贵的粘细菌资源有太多未知有待探索，如淡水生境中粘细菌资源的多样性情况；粘细菌对水体污染及水华现象是否具有一定的防治作用；粘细菌捕食不同微生物的具体机制；目前对粘细菌防治病原真菌有相关报道，然而对病原细菌防治是否具有相同的机制还不清楚；此外，粘细菌对人类及动物病原菌是否具有一定的防治作用等都值得探索。尤其值得关注的是粘细菌在生态系统中的功能，除了分泌水解酶抑制病原菌外，作为捕食性细菌的粘细菌是否在生态系统中发挥更广泛的调节功能值得深入研究。