柑橘果实多甲氧基黄酮的提取、富集与分离纯化方法研究

阅读量：

237

作者：

赵梓燕

展开

摘要：

本研究以4个柑橘品种('大红袍'红橘,'纽荷尔'脐橙,'尤力克'柠檬和'梁平'柚)的果实为实验材料,采用超高效液相色谱-飞行时间质谱(Ultra performance liquidchromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS/MS)对其果皮和果肉中主要的类黄酮进行测定;选取多甲氧基黄酮(Polymethoxyflavones,PMFs)含量最丰富的红橘果皮为材料,优化了总多甲氧基黄酮(TPMF)的提取条件;利用大孔吸附树脂对PMFs粗提物中的TPMF进行富集纯化,并应用质谱引导的制备型高效液相色谱同时分离了多种PMFs单体.主要研究内容如下:(1)4个柑橘品种果实中主要类黄酮的测定:采用UPLC-Q-TOF-MS/MS对4种柑橘果实中主要类黄酮成分进行测定,鉴定出16种主要的类黄酮,包括7种黄烷酮和9种PMFs.考察了基于UPLC-PDA的柑橘类黄酮含量测定法,16种类黄酮的线性关系均良好,检出限和定量限分别小于0.7167和1.7917μg/mL,日内和日间精密度分别为0.70%-1.07%和0.38%-1.67%,加标回收率为92.95%-105.71%,该方法准确可靠,适用性良好.基于该方法,本研究比较了柑橘不同品种,不同采样地点和不同果实部位中类黄酮的分布,结果表明:'大红袍'红橘中的PMFs种类及TPMF含量均优于其它三个品种,PMFs仅在果皮中有检出,而果肉无检出.(2)PMFs提取条件的优化:以'大红袍'红橘果皮为实验材料,利用单因素实验研究各提取因素(提取方式,提取溶剂,料液比,温度,时间和提取次数)对TPMF提取量的影响,并通过响应面设计进一步优化提取条件.获得的最佳提取条件为:超声波辅助提取TPMF,液料比1:20,提取溶剂为89.1%乙醇/水溶液,提取温度40.9℃,单次提取时间为34.1 min,重复提取2次,在此条件下红橘果皮的TPMF提取量为11.09 mg/g DW.(3)PMFs富集纯化方法的建立:以'大红袍'红橘果皮提取所得的PMFs粗提物为材料,比较了8种大孔吸附树脂(HPD100,HPD300,HPD400,HPD600,NKA-9,D101,DM130和AB-8)对TPMF的静态吸附和解吸能力,结果表明:HPD300型大孔树脂对TPMF的富集效果最佳.对HPD300型树脂吸附TPMF的吸附动力学和热力学研究发现,该树脂对TPMF的吸附过程符合准二级吸附模型和Langmuir方程,吸附速率主要受液膜扩散控制.基于动态吸附和解吸附的单因素实验,分析得出富集纯化TPMF的最佳工艺为:以TPMF浓度为8.70 mg/mL的粗提液上样,上样流速4.0 BV/h,上样体积11 BV;用7%乙醇溶液预先洗脱6 BV进行除杂,再以90%乙醇水溶液为洗脱液,洗脱流速4.0 BV/h,洗脱体积4 BV.经HPD300型树脂富集纯化后,干燥状态下PMFs粗提物中的TPMF含量由31.720±1.255 mg/g提高到594.57±28.05 mg/g.(4)PMFs单体的制备及鉴定:应用质谱引导的制备型液相色谱对PMFs单体进行同时分离和制备,建立了最佳的液相分离条件:采用XBridge Prep RP18制备柱(19×250 mm,5μm),流动相为0.1%甲酸/乙腈(A)和0.1%甲酸/水(B),流速为20 mL/min,洗脱梯度为0-6 min,18%-30%A;6-35 min,30%-42%A;35-45 min,42%-60%A;45-50 min,60%-18%A.所得单体经UPLC-Q-TOF-MS/MS和核磁共振~1H谱,~(13)C谱鉴定其结构,结果表明,从红橘果皮PMFs粗提物中分离得到了甜橙黄酮,5,6,7,4'-四甲氧基黄酮,川陈皮素,橘皮素和5-羟基-6,7,8,3',4'-五甲氧基黄酮5种PMFs单体,纯度均高于95.3%.

展开

关键词：

多甲氧基黄酮；红橘；大孔树脂；制备型液相色谱；分离纯化

学位级别：

硕士

DOI：

CNKI:CDMD:2.1018.860275