中药青蒿本草考证及DNA鉴定

2023-08-09 20:10| 来源: 网络整理| 查看: 265

历版《中华人民共和国药典》规定菊科蒿属植物黄花蒿Artemisia annua L.为中药青蒿正品来源[1]。但是,植物学上另外一种与黄花蒿A. annua形态较相似的同属植物Artemisia carvifolia Buch.-Ham也叫青蒿[2]。这导致许多学术争论和使用上的混乱[3, 4, 5, 6]。中药青蒿作为传统药材,有两千多年的记载历史,最早见于春秋战国时期的《五十二病方》。我国蒿属植物种类繁多,《中国植物志》第76卷2分册记载,蒿属植物全球约300余种,我国有186种,44变种,遍布全国[2]。同科属的植物茵陈蒿A. capillaris、牡蒿A. japonica、南牡蒿A. eriopoda、猪毛蒿A. scoparia、臭蒿A. hedinii等在地方上有混用的情况,但是经过研究已经与中药青蒿的关系澄清[5]。由于名称和形态上的相似,中药青蒿与植物青蒿的关系依然比较容易混淆。本文对历代本草涉及中药青蒿的形态、分布、物候等资料进行了重新梳理,并对植物黄花蒿和青蒿学分类特征进行了比较,同时结合DNA条形码技术,对黄花蒿、青蒿及其易混淆的物种进行了分析,为中药青蒿的来源与正名提供参考依据。

材料与方法实验材料

本文共收集到包括黄花蒿、青蒿及臭蒿、猪毛蒿等易混淆的蒿属17个物种共126份样品 (表 1)。黄花蒿采自海南省、重庆市、湖南省、安徽省、甘肃省、山东省、吉林省等,共28份样品。青蒿采自浙江省和江苏省,共3份样品。其余物种产地及样品信息见表 1。所有样本经中国医学科学院药用植物研究所药用植物分类鉴定专家林余霖研究员鉴定,凭证标本保存于中国中医科学院中药研究所。所有序列均提交到GenBank中,序列号信息见表 1。另外,从GenBank中下载一条鄂西苍术Atractylodes carlinoides (JX083785) 的IT2序列作为外类群进行系统聚类树分析。

表1(Table 1) Table 1 Sample informations of Artemisia annua and A. carvifolia Species Samplenumber Collecting locality Number GenBank accession number IT2 psbA-trnH Artemisia annua HHH1-2 Hefei City, Anhui Province 2 KU555591-92 KU555718-19 HHH3-6 Beijing City 4 KU555593-96 KU555720-23 HHH7 Gansu Province 1 KU555597 KU555724 HHH8 Wudu City, Gansu Province 1 KU555598 KU555725 HHH9 Nanning City, Guangxi Province 1 KU555599 KU555726 HHH10 Haikou City, Hainan Province 1 KU555600 KU555727 HHH11 Hebei Province 1 KU555601 KU555728 HHH12-13 Nanyang City, Henan Province 2 KU555602-03 KU555729-30 HHH14 Shennongjia Forestry District, Hubei Province 1 KU555604 KU555731 HHH15-16 Loudi City, Hunan Province 2 KU555605-06 KU555732-33 HHH17-18 Sangzhi County, Hunan Province 2 KU555607-08 KU555734035 HHH19-20 Meihekou City, Jilin Province 2 KU555609-10 KU555736-37 HHH21-22 Linyi City, Shandong Province 2 KU555611-12 KU555738-39 HHH23 Beijing City 1 KU555613 KU555740 HHH24 Nanning City, Guangxi Province 1 KU555614 KU555741 HHH25 Youyang County, Chongqing City 1 KU555615 KU555742 HHH26-27 Yunyang County, Chongqing City 2 KU555616-17 KU555743-44 HHH28 Chongqing City 1 KU555618 KU555745 Artemisia carvifolia QH1 Ningbo City, Zhejiang Province 1 KU555619 − QH2 Hangzhou City, Zhejiang Province 1 KU555620 KU555746 QH3 Nanjing City, Jiangsu Province 1 KU555621 − Artemisia hedinii CH1-2 Qinghai Province 2 KU555622-23 KU555747-48 Artemisia vestita MLH1-3 Dangchang County, GansuProvince 3 KU555624-26 KU555749-51 Artemisia eriopoda NMH1 Hebei Province 1 KU555627 KU555752 NMH2 Wutai Mountain, Shanxi Province 1 KU555628 − Artemisia gmelinii XYLH1-3 Lasa City, Tibet 3 KU555629-31 KU555753-55 Artemisia scoparia ZMH1-5 Daofu County, Sichuan Province 5 KU555632-36 KU555756-60 ZMH6-8 Wen County, Gansu Province 3 KU555637-39 KU555761-63 Artemisia argyi A1-4 Liuan City, Anhui Province 4 KU555640-43 KU555764-67 A5-10 Lanzhou City, Gansu Province 6 KU555644-49 KU555768-73 A11-14 Guangzhou City, GuangdongProvince 4 KU555650-53 KU555774-79 A15-19 Nanxiong City, GuangdongProvince 5 KU555654-58 KU555778-82 A20 Zhongshan City, GuangdongProvince 1 KU555659 KU555783 A21 Zhumadian City, Henan Province 1 KU555660 KU555784 A22-28 Qichun County, Hubei Province 7 KU555661-67 KU555785-91 A29 Ning County, Hunan Province 1 KU555668 KU555792 A30 Dongtai City, Jiangsu Province 1 KU555669 KU555793 A31 Yangzhou City, Jiangsu Province 1 KU555670 KU555794 A32 Dalian City, Liaoning Province 1 KU555671 KU555795 A33 Taizhong City, Taiwan 1 KU555672 KU555796 A34-37 Kunming City, Yunnan Province 4 KU555673-76 KU555797-800 A38-40 Ningbo City, Zhejiang Province 3 KU555677-79 KU555801-03 A41-42 Liaoning Province 2 KU555680-81 KU555804-05 A43 Zhangqiu City, ShandongProvince 1 KU555682 KU555806 A44-45 Yunnan Province 2 KU555683-84 KU555807-08 A46 Zhejiang Province 1 KU555685 KU555809 Artemisia indica WYA1 Liaoning Province 1 KU555686 KU555810 WYA2 Guiling City, Guangxi Province 1 KU555687 KU555811 WYA3 Jiaocheng County, ShanxiProvince 1 KU555688 KU555812 WYA4-5 Ning County, Hunan Province 2 KU555689-90 KU555813-14 WYA6-8 Chongqing City 3 KU555691-93 KU555815-17 WYA9 Zhangqiu City, ShandongProvince 1 KU555694 KU555818 WYA10 Guangzhou City, GuangdongProvince 1 KU555695 KU555819 Artemisia stolonifera KSH1-2 Wenshan City, Yunnan Province 2 KU555696-97 KU555820-21 Artemisia lavandulifolia YAH1-2 Nanning City, Guangxi Province 2 KU555698-99 KU555822-23 Artemisia capillaris YCH1-3 Beijing City 3 KU555700-702 KU555824-26 Artemisia anomala QQH1-2 Chongqing City 2 KU555703-04 KU555827-28 QQH3-4 Chongqing City 2 KU555705-06 KU555829-30 Artemisia aurata HJH1-3 Kunming City, Yunnan Province 3 KU555707-09 KU555831-33 Artemisia vexans ZDH1-3 Kunming City, Yunnan Province 3 KU555710-12 KU555834-36 Artemisia tangutica GQH1-2 Guangzhou City, GuangdongProvince 2 KU555713-14 KU555837-38 Artemisia igniaria QJH1-2 Nanyang City, Henan Province 2 KU555715-16 KU555839-40 Table 1 Sample informations of Artemisia annua and A. carvifolia DNA提取及PCR扩增

取样品叶片约20 mg,用组织研磨仪 (Sceitz,宁波新芝) 研磨120 s,用植物基因组DNA提取试剂盒 (Tiangen Biotech CO. China) 提取样品总DNA。详细操作步骤参见《中国药典中药材DNA条形码标准序列》药材“青蒿Artemisiae Annuae Herba”项下,以及试剂盒操作说明[7, 8]。

PCR扩增及测序

选用药用植物通用的ITS2及psbA-trnH序列作为DNA条形码[9, 10, 11, 12, 13]。PCR扩增选用通用引物,ITS2序列正向引物ITS2F (5'-ATGCGA TACTTGGTGTGAAT-3'),反向引物ITS3R (5'-GACG CTTCTCCAGACTACAAT-3'); psbA-trnH序列正向引物trnH (5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'),反向引物psbA (5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3')。PCR反应体系及扩增程序等参考《中国药典中药材DNA条形码标准序列》中的标准流程[7]。PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳检测,取条带单一且清晰的样品,经纯化后,用ABI3730XL测序仪 (Applied Biosystems Co. USA) 进行双向测序。

数据处理及分析

用Codon Code Aligner V 4.2 (Codon Code Co. USA) 对测序峰图进行校对拼接,去除低质量序列及引物区,获得psbA-trnH序列。ITS2序列需采用HMMer注释法去除所得序列的5.8S和26S,获得ITS2间隔区序列。利用MEGA 5.0进行序列比对及Kimura-2-Parameter (K2P) 遗传距离分析。基于邻接(Neighbor Joining,NJ) 法构建系统聚类树,各分支的支持率使用bootstrap重复1 000次进行检验[12, 13]。

结果与分析 1 本草青蒿的特征及相应品种

青蒿之名,最早见于《五十二病方》。在本草书《神农本草经》名草蒿,又名青蒿,“味苦,寒。主疥瘙、痂痒、恶创,杀虫,留热在骨节间,明目。一名青蒿,一名方溃。生川泽”。其后本草书籍诸如《名医别录》、《本草经集注》、《新修本草》等均收录此药,但并无该药物植物形态的描述。至五代后蜀韩保昇《蜀本图经》始对其植物形态进行描述。现将古代典籍中对中药青蒿植物形态描述的相关文献摘录如下:

《蜀本草》载: 叶似茵陈蒿而背不白,高四尺许。四月、五月采苗,日干。江东人呼为蒿,为其臭似,北人呼为青蒿[14]。

宋代《本草图经》载: 草蒿,即青蒿也。生华阴川泽,今处处有之。春生苗,叶极细,嫩时人亦取杂诸香菜食之,至夏高三、五尺; 秋后开细淡黄花,花下便结子,如粟米大,八、九月间采子,阴干。根、茎、子、叶并入药用,干者炙作饮香,尤佳[15]。其后《本草原始》、《食物本草》、《本草述》等众多明清著作多摘录此文。

明代兰茂《滇南本草》载: 青蒿,形似蒿,开黄花,生子如粟米大[16]。

明代陈嘉谟《本草蒙筌》载: 谚云三月茵陈四月蒿,人每诵之。只疑两药一种,因分老嫩而异名也。殊不知叶虽近藨似,种却不同。草蒿叶背两面俱青,且结花实; 茵陈叶面青而背白,花实全无。况遇寒冬,尤大差异。茵陈茎干不凋,至春复旧干上发叶,因干陈老,故名茵陈。草蒿茎干俱凋,至春再从根下起苗,如草重出,乃名草蒿[17]。

明代《本草纲目》载: 青蒿,二月生苗,茎粗如指而肥软,茎叶色并深青。其叶微似茵陈,而面背俱青。其根白硬。七八月开细黄花颇香。结实大如麻子,中有细子[18]。

从上述文献对药材青蒿的描述可见古时所用的青蒿植物形态基本一致,具有根白硬; 茎深青如指粗; 叶极细,似茵陈而面背俱青; 秋后 (七八月) 开花,淡黄或黄色花,颇香; 结实如大麻子,中有细子,如粟米大; 植株高三至五尺 (相当于现在的90～160 cm) 左右的特点。以这些特点为特征进行比对 (表 2),并结合历代本草所绘青蒿药图 (图 1),发现现代植物学中的菊科植物黄花蒿Artemisia annua L.与青蒿Artemisia carvifolia Buch.-Ham.均符合这些特征[2]。

表2(Table 2) Table 2 Comparision of morphological characteristics between “Qinghao” described in ancient books and Artemisia annua and A. carvifolia Item “Qinghao” Artemisia annua Artemisia carvifolia Plant tall 3−5 “chi” tall (Bencao Tujing 《本草图经》);4 “Chi” tall (Shu Bencao 《蜀本草》). 70−160 (200) cm tall. 30−150 cm tall. Root White and hard root (Bencao Gangmu《本草纲目》). Single main root, vertical, white color. Single main root, white color. Stem Finger thick stem, green in color (Bencao Gangmu 《本草纲目》). Green when immature, and turn into brown or henna when mature. Green when immature, and turn into brown when mature. Leaf Very thin leaves (Bencao Tujing 《本草图经》); Leaf morphology similar to Herba Artemisiae Capillariae, but the back is not white (Shu Bencao 《蜀本草》); Both sides of leaves are green (Bencao Mengquan 《本草蒙筌》); Leaf morphology similar to Herba Artemisiae Capillariae, but both sides are green (Bencao Gangmu 《本草纲目》). Paper-like green leaves. Lowermost stem leaves: leaf blade ovate or triangular-ovate, 3−7 × 2−6 cm, 3 (or 4)-pinnatipartite; segments 5−8 (−10) pairs. Middle stem leaves: petiole 1−2 cm; leaf blade 2 (or 3)-pinnatisect or pectinatisect; lobules deeply serrate to pectinate; teeth triangular, 1−2 × ca. 0.5 mm; rachis narrowly winged, sparsely serrate or not; midvein prominent adaxially. Uppermost leaves and leaf like bracts 1 (or 2)- pinnatipartite. Synflorescence a panicle to 15 × 8 cm, produced from most nodes to form broad, conical co mpound panicle. Green leaves. Basal and lowermost stem leaves usually withering before anthesis. Middle stem leaves: petiole 5−10 mm; leaf blade oblong, oblong- ovate, or elliptic, 5−15 × 2−5.5 cm, abaxially green, 2-or 3-pinnatisect; segments 4−6 pairs, pectinate or lanceolate; lobules pectinate, acutely or acuminately serrate; rachis serrate. Uppermost leaves and leaf like bracts 1 (or 2)-pinnatisect and pectinatisect. Flower Corolla light yellow (Bencao Tujing 《本草图经》); Corolla yellow (Diannan Bencao 《滇南本草》); Corolla yellow, aromatic (Bencao Gangmu 《本草纲目》). Synflorescence a panicle to 15 × 8 cm, produced from most nodes to form broad, conical co mpound panicle. Capitula many, shortly pedunculate, closely subtended by whorl of bracteoles, nodding. Involucre globose, 1.5−2.5 mm in diam.; phyllaries broad and scarious, ± glabrous. Marginal female florets 10−18. Disk florets 10−30, bisexual. Corolla dark yellow or yellow, strongly aromatic. Synflorescence a moderately broad panicle. Capitula many; peduncle slender, 2−6 mm, nodding. Involucre hemispheric, 3.5−7 mm in diam.; phyllaries oblong, radiately spreading or not, scarious margin yellow. Marginalfemale florets 10−20; corolla ca. 1.5 mm. Disk florets 30−40, bisexual. Corolla yellowish, aromatic. Fruit Millet like fruit (Bencao Tujing 《本草图经》); Hempseed like fruit (Bencao Gangmu 《本草纲目》). Achenes ellipsoid-ovoid. Flower and fruit fromAuguest to October. Achenes oblong or ellipsoid. Flower and fruit from Jun to September. Table 2 Comparision of morphological characteristics between “Qinghao” described in ancient books and Artemisia annua and A. carvifolia Figure 1

Figure 1 Figure 1 Drawings of “Qinghao” in ancient books

黄花蒿与青蒿植物形态极其相似,二者的显著区别在于中部叶和头状花序 (表 2)[3]。黄花蒿与青蒿的主要鉴别点在于中部叶背面的颜色,有无腺点,叶中轴或羽轴两侧是否有栉齿,中肋是否凸起; 以及头状花序的大小和排列特征 (表 2)。而古代文献并未记载到这两个具有鉴定意义的形态特征。黄花蒿花色深黄,青蒿花色淡黄,而《本草图经》中说中药青蒿“细淡黄花”,《本草纲目》说中药青蒿“开细黄花”,虽然花色不能作为鉴别中药青蒿品种的关键证据,但古籍本草对花色描述的细微差别中也反映了中国古代本草青蒿存在混用情况。

2 古时青蒿两个物种的讨论

古代的医药学家确实已经认识到了青蒿存在混用情况,并对二者加以区分。

宋代沈括《梦溪笔谈》说: 蒿之类至多,如青蒿一类,自有两种,有黄色者,有青色者,《本草》谓之青蒿,亦恐有别也。陕西绥银之间有青蒿,在蒿丛间有一两株,迥然青色,土人谓之香蒿。茎叶与常蒿悉同,但常蒿色绿,而此蒿色青翠,一如松桧之色。至深秋,余蒿并黄,此蒿尤青,气颇芬芳,恐古人所用,以此为胜[19]。

清代张璐《本经逢原》说: 茎紫者良。青蒿亦有二种,一种发于早春,叶青如绵茵陈,专泻丙丁之火,能利水道,与绵茵陈之性不甚相远。一种盛于夏秋,微黄如地肤子,专司甲乙之令,为少阳、厥阴血分之药。故茎紫者为良,其治骨蒸劳热,有杀虫之功[20]。

宋代沈括认为中药青蒿两个品种的区别主要在于二者的颜色,一种为黄色,一种为青色,青色者为青蒿,至深秋植株依然青翠,是正品药材。清代张璐认为中药青蒿的两个品种发芽的时间也有所不同: 一种发于早春; 一种盛于夏秋。青蒿花果期为6～9月,而黄花蒿花果期为8～11月,杨丽英等[21, 22, 23]观察发现黄花蒿种子成熟期为11月中旬至12月上旬,显然黄花蒿的物候期较青蒿的物候期晚。清代张璐认为中药青蒿茎紫者良[20],但是黄花蒿和青蒿的茎幼时均为绿色,后变褐色或红褐色。因此,张璐所说的青蒿两个品种并非指是黄花蒿和青蒿,而很有可能指黄花蒿和青蒿的两个不同生长阶段。

值得注意的是在明代《本草纲目》中首次收录了药物“黄花蒿”,李时珍说: “此蒿与青蒿相似,但此蒿色绿带淡黄,气辛臭不可食,人家采以罨酱黄酒曲者是也。”这里的药物黄花蒿虽与现代植物学所说黄花蒿同名,但其具有“气辛臭不可食”的特点,而黄花蒿具有浓烈的挥发性香气,二者气味相悖,显然并非一种。《本草纲目》说黄花蒿又名臭蒿,从其形态及辛臭气味推断,该品种应为现代植物学所说的菊科与黄花蒿同属植物臭蒿Artemisia hedinii Ostenf. et Pauls.

3 黄花蒿与青蒿及其混淆品种的序列特征

经过DNA提取、PCR扩增及测序后,共得到126条ITS2序列及123条psbA-trnH序列 (图 2)。黄花蒿及五月艾A. indica、宽叶山蒿A. stolonifera、野艾蒿A. lavandulifolia、奇蒿A. anomala、黄金蒿A. aurata等11种蒿属植物的序列长度均为225 bp。青蒿ITS2序列长度为224 bp,茵陈蒿、南牡蒿、臭蒿和猪毛蒿的序列长度均为226 bp。艾A. argyi的ITS2序列均无变异位点。五月艾、宽叶山蒿、野艾蒿、奇蒿、黄金蒿、藏东蒿A. vexans、甘青蒿A. tangutica、歧茎蒿A. igniaria、臭蒿的ITS2序列均无种内变异位点存在。黄花蒿、青蒿、猪毛蒿、毛莲蒿A. vestita、南牡蒿、茵陈蒿、细裂叶莲蒿A. gmelinii均只存在一个C/T变异。17个物种的126条ITS2序列比对后长 227 bp,黄花蒿、野艾蒿、奇蒿和歧茎蒿分别在62、42、216和185位点存在1个单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphism,SNP) 位点; 青蒿在199位点存在一个T的SNP位点,在193位点存在一个碱基缺失; 臭蒿在198位点存在一个SNP位点,在32位点存在一个碱基插入。黄花蒿与青蒿的ITS2序列存在12个变异位点,分别为29、43、47、163、167及199位点的T/C变异,62、186和187位点的A/T变异及181和188位点的G/A变异,并且在193位点,青蒿存在一个bp的缺失。

Figure 2

Figure 2 Figure 2 Variable sites of ITS2 and psbA-trnH sequences in Artemisia species. A: ITS2; B, C: psbA-trnH

17个物种的psbA-trnH序列长度变化较大,最长的为青蒿,长度487 bp; 最短的为黄花蒿,长度353 bp; 青蒿长398 bp。除艾、五月艾和和茵陈蒿存在变异位点外,其余14个物种的psbA-trnH序列均无种内变异位点。46条艾叶共有5条单倍型,分别在264、295、296位点存在T/G变异,在297位点存在C/A变异。五月艾在295位点存在T/G变异; 茵陈蒿在12位点存在一个A的插入。123条psbA-trnH序列比对后长540 bp,奇蒿在7、114和402位点各存在1个SNP位点; 细裂叶莲蒿在235和364位点各存在一个变异位点,在307位点存在21 bp的插入; 毛莲蒿在307位点存在22 bp的插入; 臭蒿在154位点存在一个SNP位点,在269、348和412位点分别存在一个22、4和1 bp的插入; 甘青蒿在348位点也存在一个4 bp的插入。由于本文收集的青蒿样本存放时间较长,只得到一条psbA-trnH序列,该序列与28条黄花蒿的psbA-trnH序列完全相同,与GenBank中青蒿唯一的一条psbA-trnH序列FJ418751存在2个变异位点和10 bp的缺失。

4 遗传距离及NJ树分析

基于ITS2序列,奇蒿、艾、黄金蒿、臭蒿、歧茎蒿、五月艾、宽叶山蒿、甘青蒿和藏东蒿的种内遗传距离均为0; 除艾、茵陈蒿、南牡蒿和猪毛蒿以外,黄花蒿、青蒿与其余物种的最大种内K2P遗传距离均小于最小种间遗传距离 (表 3)。基于psbA-trnH序列,除艾、五月艾和毛莲蒿外,其余物种的psbA-trnH序列种内K2P遗传距离均为零 (青蒿和南牡蒿除外);奇蒿、黄金蒿、细裂叶莲蒿、臭蒿的最大种内K2P遗传距离均小于最小种间遗传距离,能与其他物种区分开。

表3(Table 3) Table 3 The sequence characters and K2P genetic distances of ITS2 and psbA-trnH sequences in Artemisia species Sequence Latin name Samplenumber Length/bp GCcontent/% Intraspecific K2Pdistances (mean) Interspecific K2Pdistances (mean) ITS2 Artemisia annua 28 225 54.7 0−0.0045 (0.000 3) 0.018 0−0.080 6 (0.047 8) Artemisia carvifolia 3 224 54.6 0−0.004 5 (0.003) 0.032 1−0.071 6 (0.049 7) Artemisia anomala 4 225 56.4 0 0.027 3−0.070 7 (0.046 5) Artemisia argyi 46 225 56.4 0 0−0.086 4 (0.039 3) Artemisia aurata 3 225 56.9 0 0.004 5−0.070 9 (0.029 7) Artemisia capillaris 3 226 59.1 0−0.004 4 (0.003) 0−0.112 8 (0.073 5) Artemisia eriopoda 2 226 58.6 0.004 4 (0.004 4) 0.004 4−0.112 8 (0.072 3) Artemisia gmelinii 3 225 55.0 0−0.004 5 (0.003) 0.009 0−0.076 0 (0.050 3) Artemisia hedinii 2 226 53.5 0 0.018 0−0.075 8 (0.038 1) Artemisia igniaria 2 225 54.2 0 0.013 5−0.112 8 (0.047 9) Artemisia indica 10 225 56.9 0 0.004 5−0.081 2 (0.028 1) Artemisia lavandulifolia 2 225 55.3 0.004 5 (0.004 5) 0.013 5−0.091 3 (0.037 4) Artemisia stolonifera 2 225 55.1 0 0.013 5−0.102 4 (0.038) Artemisia tangutica 2 225 55.0 0 0.018 0−0.066 2 (0.028 1) Artemisia vestita 3 225 54.1 0−0.004 5 (0.003) 0.009 0−0.086 1 (0.049 1) Artemisia vexans 3 225 57.3 0 0.004 5−0.076 0 (0.029 5) Artemisia scoparia 8 226 59.1 0−0.004 4 (0.002 5) 0−0.112 8 (0.075 7) psbA-trnH Artemisia annua 28 353 25.2 0 0−0.017 2 (0.010 1) Artemisia carvifolia 1 398 26.6 − 0−0.017 2 (0.007 2) Artemisia anomala 4 362 24.6 0 0.008 3−0.022 4 (0.014) Artemisia argyi 46 483 29.1 0-0.006 2 (0) 0−0.022 4 (0.007 9) Artemisia aurata 3 362 24.6 0 0.002 8−0.016 8 (0.006 4) Artemisia capillaris 3 362 24.6 0 0−0.028 1 (0.018 2) Artemisia eriopoda 1 484 28.7 − 0−0.023 1 (0.015 5) Artemisia gmelinii 3 446 25.3 0 0.004 5−0.025 3 (0.013 2) Artemisia hedinii 2 517 29.2 0 0.010 3−0.028 1 (0.014 4) Artemisia igniaria 2 362 25.1 0 0−0.022 4 (0.008 1) Artemisia indica 10 414 25.7 0−0.007 3 (0.002 6) 0−0.025 4 (0.007) Artemisia lavandulifolia 2 362 24.9 0 0−0.019 6 (0.006 2) Artemisia stolonifera 2 362 24.9 0 0−0.019 6 (0.006 2) Artemisia tangutica 2 366 24.6 0 0−0.019 6 (0.006 1) Artemisia vestita 3 487 27.6 0.002 1−0.004 1 (0.002 7) 0.002 8−0.025 3 (0.009 9) Artemisia vexans 3 362 24.9 0 0−0.019 6 (0.006 2) Artemisia scoparia 8 457 28.7 0 0−0.024 5 (0.016 5) Table 3 The sequence characters and K2P genetic distances of ITS2 and psbA-trnH sequences in Artemisia species

基于ITS2序列,黄花蒿与毛莲蒿的K2P遗传距离最近0.018 0～0.027 3 (0.019 7),甘青蒿次之0.022 6～0.027 3 (0.022 8),与猪毛蒿、南牡蒿和茵陈蒿遗传距离最远,范围均为0.070 4～0.080 6; 青蒿与甘青蒿0.032 1～0.037 1 (0.035 4) 的遗传距离最近,与五月艾次之0.036 9～0.041 7 (0.040 0),与歧茎蒿遗传距离最远,为0.066 2～0.071 3 (0.069 6) (表 4)。基于psbA-trnH序列,黄花蒿与青蒿之间的K2P遗传距离最近,为0; 黄花蒿与茵陈蒿、南牡蒿遗传距离最远,均为0.017 2; 青蒿仅与茵陈蒿遗传距离最远,为0.017 2,南牡蒿次之,为0.015 2。

表4(Table 4) Table 4 The interspecific K2P distances between Artemisia annua and A. carvifolia and closely related species or counterfeits Latin name ITS2 psbA-trnH Artemisia annua Artemisia carvifolia Artemisia annua Artemisia carvifolia Artemisia annua − 0.046 3−0.056 0 (0.049 7) − 0 (0) Artemisia carvifolia 0.046 3−0.056 0 (0.049 7) − 0 (0) − Artemisia argyi 0.046 2−0.051 0 (0.046 3) 0.041 7−0.046 6 (0.044 9) 0.002 8−0.011 4 (0.008 9) 0.002 5−0.010 1 (0.007 9) Artemisia indica 0.041 4−0.046 2 (0.041 5) 0.036 9−0.041 7 (0.040 0) 0.005 7−0.011 5 (0.009 1) 0.005 2−0.010 4 (0.008 3) Artemisia stolonifera 0.051 0−0.055 9 (0.051 2) 0.054 6−0.061 4 (0.059 7) 0.008 5 (0.008 5) 0.008 6 (0.008 6) Artemisia lavandulifolia 0.046 0−0.055 7 (0.048 6) 0.046 4−0.051 3 (0.049 6) 0.008 5 (0.008 5) 0.008 6 (0.008 6) Artemisia capillaris 0.070 4−0.080 6 (0.074 0) 0.061 4−0.071 6 (0.068 2) 0.017 2 (0.017 2) 0.017 2 (0.017 2) Artemisia anomala 0.050 9−0.055 7 (0.051 0) 0.051 3−0.056 2 (0.054 6) 0.008 6 (0.008 6) 0.008 6 (0.008 6) Artemisia aurata 0.041 4−0.046 2 (0.041 5) 0.046 6−0.051 5 (0.049 8) 0.005 7 (0.005 7) 0.005 7 (0.005 7) Artemisia vexans 0.046 2−0.051 0 (0.046 3) 0.041 7−0.046 6 (0.044 9) 0.008 5 (0.008 5) 0.008 6 (0.008 6) Artemisia tangutica 0.022 6−0.027 3 (0.022 8) 0.032 1−0.037 1 (0.035 4) 0.008 5 (0.008 5) 0.008 6 (0.008 6) Artemisia igniaria 0.055 7−0.060 7 (0.055 9) 0.066 2−0.071 3 (0.069 6) 0.011 4 (0.114) 0.011 5 (0.011 5) Artemisia hedinii 0.031 8−0.036 5 (0.032 0) 0.041 6−0.046 4 (0.044 8) 0.011 4 (0.114) 0.012 7 (0.012 7) Artemisia vestita 0.018 0−0.027 3 (0.019 7) 0.056 2−0.066 2 (0.061 2) 0.008 5−0.014 3 (0.011 4) 0.007 6−0.012 7 (0.010 1) Artemisia eriopoda 0.070 4−0.080 6 (0.073 2) 0.056 4−0.066 5 (0.062 3) 0.017 2 (0.017 2) 0.015 2 (0.015 2) Artemisia gmelinii 0.027 3−0.036 7 (0.029 0) 0.056 2−0.066 2 (0.061 2) 0.014 3 (0.014 3) 0.012 7 (0.012 7) Artemisia scoparia 0.070 4−0.080 6 (0.073 2) 0.061 4−0.071 6 (0.067 3) 0.014 4−0.017 2 (0.016 8) 0.012 7−0.015 2 (0.014 9) Table 4 The interspecific K2P distances between Artemisia annua and A. carvifolia and closely related species or counterfeits

将17个物种的126条ITS2序列进行NJ树分析,除猪毛蒿、南牡蒿和茵陈蒿外,其余的物种均单独聚为一支,猪毛蒿、南牡蒿和茵陈蒿聚为一大支,不能相互区分 (图 3)。28条黄花蒿单独聚为一支,分支自展值为87%; 3条青蒿聚为一支,分支自展值为98%。表明基于ITS2序列,黄花蒿和青蒿能相互区分,且能与混伪品和近缘物种相互区分。将17个物种的123条psbA-trnH序列进行NJ树分析,黄花蒿单独聚为一支,分支自展值为77%。青蒿只有1条psbA-trnH序列,与黄花蒿聚为一大支。奇蒿、臭蒿、黄金蒿、细叶莲蒿、茵陈蒿各自单独聚为一小支,能与别的物种相互区分,其余的物种基于psbA-trnH序列均不能完全与别的物种区分开。因此,基于ITS2序列构建的NJ树,黄花蒿、青蒿、臭蒿之间都能相互区分,且能明显与近缘物种和混伪品区分开。

Figure 3

Figure 3 Figure 3 Phylogenetic tree constructed with ITS2 sequences using NJ tree method. Note: Bootstrap repeated 1 000 times 讨论

现代中药青蒿来源为菊科植物黄花篙,但其中文名与植物青蒿相同,造成长期以来的混淆[4, 5, 6]。李时珍在《本草纲目》中除了“青蒿”外,单独列了“黄花蒿”的条目,但是却在“青蒿”项下列了“治疟疾寒热”的功效,而青蒿A. carvifolia不含青蒿素,不具有抗疟疾的功效[18]。药材名与植物名的相同,以及历代本草记载信息有限,造成了中药青蒿来源的争议。1963年、1977年版的《中华人民共和国药典》规定中药青蒿的植物来源为菊科植物黄花篙A. annua及青篙A. apiacea (A. apiacea为A. carvifolia的异名) 两个物种,而1985年至2015年版中又将中药青蒿的来源规定为“黄花蒿”一种[1, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31]。1987年,屠呦呦经过对古医药文献、原植物、资源、化学成分等进行研究,认为中药青蒿的植物来源仅为一种A. annua,中文名为青蒿[5,32]。2006年,胡世林经过本草考证,与屠呦呦的观点一致,认为中药青蒿的来源为青蒿A. annua; 同时认为就算宋代以前包括A. annua和A. carvifolia两个物种,也应该有主次、正副之分,A. annua为主,A. carvifolia为辅或者是误用混用[4]。

另外,胡世林还认为《本草纲目》中的“黄花蒿”应是中药青蒿的不同生长阶段,是青蒿A. annua的晚出异名[4]。但是1991年出版的《中国植物志》第76卷第2分册中,我国的植物分类学家林有润仍然沿用了日本学者对青蒿的命名A. apiacea,并认为A. apiacea是A. carvifolia的异名,而A. annua依然叫黄花蒿。

本文对历代本草涉及青蒿形态、物候等资料进行了重新梳理,并对现代植物学分类特征进行了比较,同时结合DNA分子鉴定技术,对黄花蒿、青蒿及其易混淆的物种进行了研究。分析结果认为: ① 黄花蒿和青蒿两个物种从形态、物候和分子方面都能进行明显的区分,为两个物种。黄花蒿与青蒿植物形态虽然极其相似,但是二者中部叶和头状花序仍然存在显著区别。二者的ITS2序列特征存在12个变异位点; 最大种内K2P遗传距离均小于最小种间遗传距离; NJ树中分别聚为单独的一支。② 对于古代文献的考证不能确定中药青蒿的单一品种来源。黄花蒿与青蒿的主要鉴别点在于中部叶背面的颜色,有无腺点,叶中轴或羽轴两侧是否有栉齿,中肋是否凸起; 以及头状花序的大小和排列特征。但是现有的古代文献对于药材青蒿源植物形态特征的描述中不包括这两点,说明黄花蒿与青蒿可能同时作为药材青蒿的品种来源进行使用。③ 虽然无法证明植物青蒿在古代是否处处有之,但是现代植物青蒿资源非常稀少是个不争的现实,开发利用价值较低。随着中药现代化的进程,处处可见的黄花蒿得到了极大的发展和利用,因含有具截疟功效的青蒿素,为人类的健康做出了极大的贡献[33, 34, 35, 36]。学者们普遍认为现代中药青蒿来源主要为黄花蒿。

青蒿素是药物研发史上最伟大的成就之一,作为抗疟新药,挽救了全球特别是发展中国家数百万人的生命[33, 34, 35, 36]。青蒿素是1971年首次发现,1973年正式确定为抗疟新药[32,37],而1963年以后的历版《中华人民共和国药典》中黄花蒿均是中药青蒿的基原植物。因此,可以说青蒿素是中医药献给世界人民的一个礼物。

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