创新药物研发中的高通量筛选方法进展

进行HTS有一定的先决条件，首先是靶标的前期确证，其次是灵敏且稳定的筛选方法，最后是结构丰富的化合物库。在HTS后，还需要对苗头化合物进行进一步的确证。常用的方法是重新购买，确认纯度，测定亲和力和浓度梯度实验，进行多方法的实验检测，再去卷积分析排除假阳性。还可以利用靶标蛋白的同源家族蛋白突变体等备选进行特异性筛选，多向印证化合物的选择性。

一、生化筛选体系

生化筛选利用纯化的靶标蛋白，在体外测定配体的结合或酶活性的抑制。这些分析通常采用竞争形式进行，即研究中的化合物必须取代已知的配体或底物。通常使用384孔板进行检测，一般采用20-50 μL的检测体积，并使用光学方法读出，如吸光度，荧光，或发光。荧光法由于其更易操作、高灵敏度和灵活性，已经在很大程度上取代了传统的放射性标记配体分析方法。常用的荧光检测方法有以下几种：

1. 总荧光分析（Fluorescence intensity, FLINT）

在固定时间内对孔的荧光值进行积分如100 ms。常用于含染料的底物，在酶催化反应后生成具有荧光的物质，如蛋白酶介导的肽荧光基团的裂解。FLINT会受到许多因素的影响，如被检测物质的自发荧光和淬灭（与被检测物质相互作用而非底物）以及加样误差等。一般来说，用于标记的染料的激发波长越长，从筛选化合物的光谱干扰就越小。

2. 荧光比率法（Ratiometric fluorescence methods）

常见的HTS筛选体系包括荧光偏振（FP）和荧光各向异性（FA）检测。此方法相较FLINT更不易受人为因素的影响，通过测定分子一定时间的旋转变化，表征相互作用对测定分子的影响。在这些技术中，使用偏振光来激发荧光团，并使用平行于和垂直于入射光偏振的偏振器来测量荧光发射。当染料标记的分子随时间翻转时，发射信号会去偏振。与大分子的结合降低了荧光团的迁移率，从而增加了偏振值或各向异性，并允许定量结合。因为不同荧光素的荧光寿命不同，利用此特性可以最大化筛选体系的灵敏度。有机染料如fluorescein和rhodamine荧光寿命约3-4 ns，当它们与约0.5-10 kD的分子结合时，检测灵敏度最高。所以荧光比率法最适合用于分子量差异很大的分子间相互作用的测定。

3. 荧光共振能量转移（FRET）

来自荧光供体的能量通过偶极-偶极相互作用被受体吸收。能量传递的效率取决于供体和受体之间的光谱重叠，它们的距离和相对方向，以及福斯特方程中的其他参数。常见的能量供受体距离是26 nm，适合许多蛋白-蛋白相互作用。

4. 时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）

是由荧光共振能量转移衍生而来的一种筛选方法。具有长寿命荧光(通常为100秒到毫秒)的镧系化合物用作荧光供体，荧光蛋白或有机荧光团(例如，别藻蓝蛋白或Cy5)用作受体。然后对受体的荧光发射进行门控(例如，延迟到50ms)，以便在信号采集时，被测化合物中短寿命有机荧光团的荧光发射已经衰减。典型的商业化合物库里分子荧光寿命在皮秒范围内。此外，350 nm供体激发和670 nm受体发射之间的大斯托克斯位移进一步有助于最小化背景信号。镧系化合物的荧光发射也表现为多个窄波长，这与有机染料的宽波长发射不同，后者允许与荧光受体进行多路复用。

5. 荧光寿命分析（Fluorescence lifetime analysis, FLA）

一种不太常见但有效的检测方法，在高通量筛选中，FLA使用时域数据采集来确定样品中存在的荧光物质的寿命。FLA的理想染料是钌络合物，其荧光寿命约为20 ns。与荧光强度的测量相比，寿命测量对样品中其他材料的颜色(如测试化合物)的敏感性要低得多。此外，在分析数据时，两种生命周期通常都适用，这允许删除寿命较短的组分，类似于TR-FRET实现的效果。

6. Alphascreen

荧光发射的波长比激发光的波长长，与其相反，AlphaScreen是一种非放射性的基于距离的分析方法，使用单线态氧敏化在较短的波长上产生发射，从而避免荧光伪影。待测分子偶联在两种不同的水凝胶包覆微珠上。供体微珠含有光敏剂(酞菁衍生物)，当被680 nm的光刺激时产生单线态氧。如果受体微珠(包含二甲基噻吩衍生物及Eu螯合物)贴近供体微珠，导致化学发光和短的波长的光发射(520-620 nm)。

二、基于亲和力的筛选体系

基于结合的分析直接观察库里化合物与目标蛋白的结合，而不考虑它们对蛋白质功能的影响。上文所述的生物化学方法则是测量酶/受体功能的改变或探针/蛋白质结合的抑制。一般来说，基于结合的测定法使用的生物物理技术比基于竞争的筛选法更耗费材料和时间，因此最常用于小型化合物库。基于结合的方法也被用于具有挑战性的孤儿靶点和药物发现过程的后期阶段，如苗头化合物验证、优化和先导化合物的优化。

1. 基于片段的药物设计(Fragment-based drug design, FBDD)

一种特别适合生物物理方法的应用。FBDD涉及片段的筛选，这些片段是小分子(