Nature综述

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单细胞测序在发育方面的应用层出不穷，但我们许多的基础知识感觉甚是欠缺，今天我们介绍来自斯坦福大学医学院和密西根大学的综述性研究，文章于2020年9月23日发表于Nature Reviews Molecular Cell Biology ，题目为 “Mechanisms of bone development and repair”，文章对不同细胞在骨形成中的作用机制进行研究，深入了解稳态和修复过程中骨骼维持和再生的机制，从而精确阐明骨修复过程中的细胞活性及其命运。

骨骼发育是通过一系列同步事件发生导致身体骨架的形成。骨骼及其周围微环境（包括炎性细胞，内皮细胞和施旺细胞）的修复潜力在整个成年期都持续存在，从而使组织恢复到其稳态功能状态。通过细胞表面标志物分离单个骨骼干细胞亚群以及单细胞技术的发展，可以深入了解稳态和修复过程中骨骼维持和再生的机制，从而精确阐明骨修复过程中的细胞活性和命运。对骨发育以及正常和异常骨修复的深入了解，对骨疾病和与衰老相关的变性的治疗具有重要的治疗意义。

骨骼肌肉系统为哺乳动物的身体提供了物理支架。人体骨骼为肌肉，肌腱和韧带提供了附着点，从而使运动成为可能。骨骼中还包含成人造血发生的微环境。人体具有通过再生来修复骨骼，将其恢复到完全功能状态的独特能力，进一步突出了骨骼在哺乳动物生理中的关键作用。研究表明，形成骨的成骨细胞与溶解吸收骨的破骨细胞（骨的两个主要细胞成分）之间的调节活性平衡是产生修复能力的原因。先前有关成骨细胞作用的研究强调了在骨修复过程中，诸如骨形态发生蛋白（BMP）和音猬蛋白（SHH）等形态发生成分的重要性。这些形态发生因子在骨骼发育（成骨）过程中也是必不可少。

成骨细胞谱系由于其对骨骼发育和疾病的影响而引起医学界的极大兴趣。尽管整个成年期都保持一定程度的修复能力，但在老化过程中，修复骨的能力大大降低，有可能导致骨质疏松。因此，本综述探讨了骨骼发育和修复过程中的协同作用和多样性。我们讨论了成骨过程中涉及的细胞类型以及对骨形成至关重要的分子信号传导途径。这篇综述还探讨了骨骼发育过程中关键基因和转录因子的功能。此外，还描述了骨修复过程中不同细胞的功能和信号通路，以及它们在骨发育中的作用。最后，我们评估了导致临床骨病的功能失调的细胞和分子信号传导，从而展现了当前的科学状况以及潜在的知识空白。

骨骼细胞谱系包括在稳态和损伤期间分别维持和修复骨骼的多种细胞，包括成骨细胞，骨细胞和软骨细胞。这些骨骼细胞类型主要参与骨骼和软骨的形成，而负责骨骼吸收的细胞（称为破骨细胞）则来自造血谱系。通过成骨细胞和破骨细胞活性之间的平衡来维持正常的骨稳态。然而，在衰老过程中，尤其是在绝经后的妇女中，破骨细胞的活性超过成骨细胞的活性，导致整体骨吸收增加，骨质变差。

成骨细胞是负责骨骼形成的主要细胞。这些细胞分泌细胞外基质蛋白，例如I型胶原蛋白，骨桥蛋白，骨钙蛋白和碱性磷酸酶。多个成骨细胞互相作用，形成一个称为osteon的骨单位。I型胶原以羟磷灰石形式沉积钙，为骨骼提供结构支撑。

成骨细胞可分为三个不同的分化阶段：骨祖细胞，前成骨细胞和成骨细胞（图1）。最初，转录因子SOX9的表达标志着对骨祖细胞的形成。SOX9表达也将细胞分化导向软骨细胞。软骨细胞是在健康软骨中发现的唯一细胞类型，它们会产生由胶原蛋白和蛋白聚糖组成的软骨基质。随后在骨祖细胞中表达RUNX2，向成骨细胞发育。在成熟阶段，WNT–β-catenin信号传导作用在前成骨细胞上，以诱导osterix（OSX；也称为SP7）的表达，该因子表达定义了细胞向成骨细胞的分化。最终，RUNX2和OSX的表达标志着对成熟成骨细胞的形成。

图1 骨稳态

这些成骨细胞的一小部分将经历凋亡，而另一部分成骨细胞分泌细胞外基质成分并嵌入骨基质中，形成骨细胞。骨细胞占成熟矿化骨骼中发现的大多数，并通过成骨细胞和破骨细胞之间的相互作用来协调骨骼的维持（图1）。骨骼的维护过程对机械压力很敏感。在释放机械负荷的过程中，破骨细胞表达核因子κB配体（RANKL）的受体活化剂，该活化剂通过破骨细胞的活化促进骨吸收。相反，响应机械负荷，骨细胞减少Dickkopf相关蛋白1（DKK1）和硬化蛋白的表达，从而通过激活成骨细胞中WNT-β catenin信号传导而增加骨形成。骨细胞响应于激素和机械信号，通过信号通路严格控制骨重塑，我们将在后面进行讨论。

破骨细胞是大型多核细胞，其主要功能是骨吸收。这些细胞起源于造血细胞系，并通过巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）和RANKL的相互作用分化为成熟的破骨细胞（图1）。M-CSF促进破骨细胞前体的增殖，而RANKL促进破骨细胞前体向成熟破骨细胞的分化。RANKL的表达对于破骨细胞功能是必需的，因为缺乏RANKL的小鼠无法吸收骨骼。在骨重塑过程中，破骨细胞的生成开始于表达RANKL的破骨细胞募集破骨细胞前体。RANKL和M-CSF在骨髓腔内的表达启动了破骨细胞前体向破骨细胞的分化，从而开始了骨重塑。在动态平衡下，骨骼形成和骨骼吸收的比率遵循严格控制，以确保骨骼质量的一致性。例如，骨基质吸收后释放活性转化生长因子β（TGFβ）和胰岛素样生长因子1（IGF1）触发成骨细胞分化，用新的骨基质代替吸收的基质。

这种控制的失衡会导致骨质疏松症，这是与破骨细胞活性上调相关的最常见疾病，当骨吸收超过骨形成时会发生（稍后将详细讨论）。相反，病理上增加的成骨细胞活性导致异位骨化由骨骼外部位的骨形成来表示。

从干细胞分化为成熟的成骨细胞需要许多步骤。间充质干细胞（MSCs）和骨骼干细胞（SSCs）均已分别显示可以产生成骨细胞。然而，这两个干细胞群之间的关系尚未精确确定。在本综述中，两个细胞亚群被单独考虑并讨论它们在成骨细胞分化中的作用。此外，在整个成骨细胞分化过程中，表达特定的基因以标记其在发育和修复过程中每个阶段的成熟。因此，为了研究每种中间细胞类型的功能，使用了转基因小鼠来了解谱系指定过程。Cre重组酶（Cre）–loxP系统可实现条件基因的失活，从而Cre切除与目标基因相对应的“目标” DNA序列，该序列侧翼有两个称为“ loxP位点”的34bp DNA序列。TAble 1概述了可用于研究成骨细胞分化过程中特定细胞类型的众多转基因小鼠模型，以及每种模型的优缺点。（巧了，本人前期做疫苗研究的时候用过该方法，不是什么基因都可以敲掉的，感觉很像玄学，我敲了整整3个月，最终课题放弃。。。）

表1 用于成骨细胞谱系研究的Cre模型

Sox9

SSCs, osteochondroprogenitor cells

Overcomes embryonic lethality of Sox9 heterozygous mutant mice; expressed throughout the lifetime of mice from the neonatal stage to old age

Potential for off-target Cre-mediated recombination in intestines and pancreas

203(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR203)

Grem1

Osteochondroprogenitor cells, bone stromal cells

Expression of cells concentrated in metaphysis; distinct from mesenchymal stem cells

Potential for off-target Cre-mediated recombination in intestines; low level of fibroblast CFUs (~1%) in in vitro studies for self-renewal

36(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR36)

Osx

SSCs, osteoblast progenitor cells

Expression is specific to osteoblasts; expression is associated with invading blood vessels during development

Unable to study precursor cells that have not committed to the osteoblast lineage fate

204(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR204)

Prrx1

SSCs

Expressed throughout the lifetime of mice from the neonatal stage to old age; presence of self-renewal properties for bulk cell culture in vitro

Potential off-target effects around the eye

205(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR205)

Sost

Mature osteocytes

Used a Sost gene within a BAC clone for better expression; no off-target effects present in osteoblasts or myocytes

Potential off-target effects in haematopoietic cells and osteoclasts

206(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR206)

Pthrp (also known as Pthlh)

SSCs, osteochondroprogenitor cells, bone stromal cells

Stromal contribution; expressed throughout the lifetime of mice from the neonatal stage to old age

Involved in long-term maintenance of skeletal integrity; predilection for chondrogenesis over osteogenesis

42(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR42)

Runx2

Mature osteoblasts

Can be used to determine gene function in mature osteoblasts; robust expression and recombination

Reporter leakage into cartilage cells

204(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR204)

Ctsk

SSCs in the periosteum

Can be used to determine the function of SSCs found in the periosteum

Potential deletion of gene in germline cells

43(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR43)

Hoxa11

SSCs in the periosteum

Labelling of cells from development until adulthood allows cell lineage tracing

Hox11+ SSCs only mark a subset of the entire SSC population

2(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR26)

MSC是在骨髓中首次发现的一种多能，非造血干细胞群。MSC具有分化为间充质组织如骨，软骨和脂肪的成熟细胞类型的能力。具体而言，通过骨髓细胞异位移植建立了MSC的成骨潜能。通过添加外源性因子，MSCs具有针对成骨细胞分化命运的能力。例如，向培养的人MSC中加入地塞米松，β­磷酸甘油和抗坏血酸盐会导致成骨细胞分化。细胞将形成结节，并且碱性磷酸酶表达增加。研究MSCs向成骨细胞的分化途径，可以洞悉分化过程中的关键时刻。

转录因子能够启动和促进MSC向成骨命运的分化。具体而言，RUNX2和OSX是主要的转录因子，其激活使细胞发育为成骨细胞系。RUNX2的表达随GLUT1的上调而增加，并导致前馈调节。GLUT1是葡萄糖转运蛋白，其上调促进了细胞对葡萄糖的吸收增加。这一系列事件表明成骨细胞分化需要很高的能量需求，这可以通过增加葡萄糖转运和通过上调GLUT1摄取来满足。这种前馈调节解释了糖尿病患者的骨愈合受损，因为他们的细胞对葡萄糖的吸收变得不敏感。

MSCs显示出维持胚胎发育特征基因的表达，例如Hox基因。Hox基因编码控制骨骼模式的进化保守转录因子。Hox基因的表达受到区域限制，并调节特定椎骨和长骨的形态。例如，在成年小鼠的肋骨中存在Hox6表达，从牛足类动物的出生后到成年的Hoxa11 +细胞具有成骨细胞祖细胞的特征。当研究成年小鼠尺骨骨折愈合中Hoxa11等位基因的功能时，Hoxa11突变小鼠表现出不稳定性骨折修复。具体来说，Hoxa11 +间充质细胞具有减少成骨细胞分化的潜力。综上所述，这些研究表明，局部受限于骨骼肌的间充质细胞保持了发育基因的表达，该基因的调节在骨修复中起作用。

根据独特的免疫表型细胞表面标记在小鼠和人类中分离SSC是一个相对较新的概念（图2）。因此，我们在这里着重于分离小鼠和人类骨骼祖细胞的能力及其在修复过程中的作用。值得注意的是，“骨骼干细胞”一词已经随着时间的流逝而发展并不断完善。

图2：骨骼干细胞层次结构

从胎儿小鼠长骨生长板分离出的细胞亚群具有分化为骨，软骨和骨基质的能力。使用普遍存在的肌动蛋白报告系统鉴定了该细胞群，该系统随机标记正在分裂的细胞及其后代，从而可以荧光追踪单个亲代细胞产生的“克隆”细胞簇。在长骨生长板上观察到克隆区域，表明存在限制性祖细胞。另外，通过荧光激活的细胞分选可以实现从生长板分离细胞。体外和体内研究表明，CD45–TER119–TIE2–ITGAV + CD200 +单细胞具有生成连续克隆形成单位，分化为骨，软骨和基质细胞并支持造血功能的能力。

由于在胎儿小鼠生长平板中进行的克隆观察，胎儿人类生长平板特别受关注。通过使用单细胞RNA测序方法，分析揭示了一组在小鼠SSC，小鼠骨骼，软骨和基质祖细胞（BCSP）及其各自的人类直系同源物中表达的76种基因候选物。通过对生长板中而不是骨干中特异富集的细胞表面标志物的观察，作者选择出了一系列潜在标志物。流式分析和生长板的免疫荧光染色显示，CD45– CD235a–TIE2–CD31–PDPN + CD73 + CD164 +人类细胞具有从单个细胞体外生成集落形成单位的能力，并能够分化成骨骼，软骨 和小鼠肾下间隙的基质。此外，在放射免疫缺陷的NSG小鼠中，将造血细胞与CD45–CD235a–TIE2– CD31–PDPN + CD73 + CD164 +人细胞共移植可以支持造血功能。SSC的作用与发育有关，但迄今为止，尚无研究成功证明SSC如何在发育中的骨骼起作用。专门标记SSC的转基因小鼠模型将使这些研究成为可能， 但是，这种模型现在尚不可用。

小鼠和人SSC的鉴定是基于转基因小鼠模型，流式细胞仪和单细胞测序的结合。尽管这些技术进步使发现SSC成为可能，但重要的是要突出已知SSC层次结构的局限性。小鼠和人类SSC的最重要的技术和概念限制之一是细胞分离中空间信息的丢失，这限制了精确定位和了解其在天然骨龛中的作用。此外，在小鼠和人类的长骨中发现了SSC，骨骼通过软骨内骨化形成。但是，不同的骨骼区室通过不同的过程发育。例如，颅骨在发展和修复过程中使用膜内骨化。SSC在两个不同的骨骼区室（颅骨与长骨）之间作用是否相同尚待确定。另外，已知小鼠和人类细胞的表面标志物是不同的。确实，小鼠和人类SSC可能是不同的细胞类型，只是在研究的体外和体内系统中表现相似。需要进一步的工作来帮助解释两个物种的免疫细胞之间的差异，从而评估这些SSC与骨骼发育和修复的更广泛生物学环境的相关性。

在受伤的情况下，出生后SSC在骨骼修复以促进愈合中具有重要作用。例如，响应骨折损伤，小鼠BCSP表达CD49f，并被激活以促进骨修复。相反，在未受伤的骨骼中不存在这些骨折引起的小鼠BCSP。在人体中，损伤可以诱导SSC激活。使用新型的人类异种移植模型，对人类胎儿指骨的皮质损伤显示出人类SSC的比例升高，并且在体外显示出更高的成骨潜能。在糖尿病小鼠中，SSCs的扩增和分化能力降低，并通过抑制hedgehog （IHH）信号传导导致骨折愈合不良。在患有糖尿病的人类患者的股骨和膝盖样本中，IHH信号也出现下调，并且通过外源加入IHH或SHH可以在小鼠中挽救这种效应，通过诱导SSC扩增成功地改善了骨愈合。在颅面部区域也观察到了一种独特的SSC驱动的修复过程，该过程是通过膜内骨化愈合的骨骼成分。在小鼠下颌骨成骨过程中，粘着斑激酶（FAK）反应性SSC获得胚胎神经嵴属性并促进再生。由于抑制了FAK，SSC 驱动的骨骼再生长受到严重损害，导致出现了纤维状的中间部位代替骨骼。这些研究突出了SSC在产后骨骼修复中的重要性。但是，迄今为止，尚无研究成功证明SSC如何促进骨骼的发育。需要进一步研究以阐明它们在胚胎发育过程中的特定作用。

通过结合两种方法：Cre–loxP系统（TAble 1）（可以进行谱系追踪）和荧光激活的细胞分选（选择SSC亚群），许多小组在了解骨骼祖细胞在骨骼重塑和维持中的作用方面取得了重大进展。根据其细胞表面标志物特征可以鉴定了不同区室中的特定骨骼祖细胞，并突出了沿谱系追踪这些骨骼祖细胞发育的能力。以谱系追踪骨骼祖细胞的能力为基础的研究将有助于阐明其在骨骼发育过程中的作用。另外，未来的进展应该解决如何从新收获的组织中分离细胞的完整性。改进的分离方法，可以防止了解发育所必需的稀疏细胞群和表面抗原的降解，揭示出更多的细胞亚群。结合新兴的单细胞转录分析和转座酶可及染色质测序方法的测定，可以建立这些细胞群与现有骨骼祖细胞的关系。

骨骼形成是十分精细的过程。骨骼发育中某些阶段的转录因子表达指导祖细胞向成骨细胞分化。伴随着遗传变化，信号传导途径使细胞能够与其周围环境进行交流。通过信号通路可以使细胞分化同步进行。骨骼发育所必需的转录因子和信号通路在受伤后随着骨骼的再生而被激活。本节讨论在骨骼发育和损伤情况下成骨细胞分化所必需的转录因子和信号通路。

在骨骼发育过程中，成骨细胞来自多个囊胚层。颅面区域的成骨细胞源自颅神经嵴细胞，其源自神经外胚层。神经外胚层发育成为颅面区域的组织，包括颅骨，牙齿的牙本质和面部的骨头。相比之下，骨骼的长骨起源于近轴中胚层（somites）和侧板中胚层。

胚胎发生过程中的骨形成有两个不同的过程：膜内骨化或软骨内骨化。膜内骨化始于直接分化为骨的间充质细胞群的聚集。身体的扁平骨骼，包括头骨，下颌骨，上颌骨和锁骨，均来自此过程。相比之下，软骨内骨化是一个复杂的过程，其特征是通过软骨中间体发展骨骼。在软骨内骨化过程中，间充质凝结中间的细胞发育成软骨细胞，开始分泌软骨基质。新分化的软骨细胞周围的细胞形成软骨膜，它定义了发育中的骨骼的边界。限定边界的细胞退出细胞周期并出现肥大，促使成骨细胞从软骨膜中分化出来。软骨细胞肥大对于激活成骨细胞分化至关重要。血管开始浸润肥大软骨，这触发了成骨细胞的分化并最终形成了骨髓腔。血管浸润具有多种功能：它促进软骨吸收细胞（其降解现有的软骨）和骨祖细胞（促进成骨细胞）的募集，并使软骨膜细胞进入发育中的骨髓腔。初级骨化中心的发展标志着血管向肥厚性软骨的浸润。

主要的骨化中心在胚胎发育过程中继续扩展，并最终形成第二个骨化中心。次生骨化中心在骨骼的生长末端发育。成长中的骨头的隔间可以通过它们在骨头中的位置来区分。在骨骺和骨干之间（中轴）是干骺端，其中包含骨骺生长板，可以进一步分为不同的发育区域（图3）。保留区包含静态软骨细胞。增殖区是软骨细胞快速复制的部位。当这些细胞分裂时，它们将自身定向为与正在生长的骨骼平行，因此以圆柱状排列。随着软骨细胞向远离骨骺的方向迁移，它们停止增殖并开始扩大（肥大），从而促进骨骼生长。这些肥大的软骨细胞大多数经历凋亡，随后软骨基质钙化，而其余的软骨细胞成为成骨细胞并有助于骨骼的生长。达到成熟的特点是封闭了包含干骺端的生长板以及骨骺和骨干的融合。

图 3 长骨解剖学

在分化过程中的特定时刻，转录因子的激活提供了必要的线索，以指明当细胞定型为成骨细胞时骨祖细胞的功能。本节讨论了成骨细胞分化的基本转录因子，例如SOX9，RUNX2，OSX和激活的转录因子4（ATF4）。此外，表2突出了整个分化过程中涉及的转录因子和蛋白质编码基因。选择这些特定的转录因子和蛋白质编码基因是因为它们与以下各节中讨论的必需转录因子相互作用，以确保适当的成骨细胞分化。血管侵入骨腔中会吸收破骨细胞以吸收钙化的软骨基质，而成骨细胞会沉积新的矿化骨组织，从而促进新形成的骨的骨化。出生后骨骼生长一直持续到青春期，直到骨骼重塑和骨化。

表2 参与成骨细胞分化的转录因子和蛋白质编码基因

Transcription factor

AP-1

Regulates osteoblast homeostasis

Enhances RUNX2 expression

76(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR76)

FIAT

Reduces osteoblast activity

Antagonizes ATF4 function

208(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR208)

FOXO

Increases osteoblast numbers

Interacts with ATF4

209(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR209)

GLI1

Stimulates osteoblast differentiation

Enhances RUNX2 activity

92(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR92)

GLI2

Stimulates osteoblast differentiation

Enhances RUNX2 activity

210(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR210)

GLI3

Suppresses osteoblast differentiation

Inhibits DNA binding of RUNX2

211(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR211)

HAND2

Inhibits intramembranous osteoblast differentiation in the mandible

Inhibits RUNX2

212(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR212)

HOX11 (also known as TLX1)

Globally patterns the appendicular skeleton

Enhances RUNX2 expression

28(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR28)

HOXA2

Suppresses osteoblast differentiation

Downregulates RUNX2 expression

213(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR213)

OSX

Stimulates osteoblast differentiation

Interacts with MSX2

65(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR65)

RUNX2

Stimulates osteoblast differentiation

Acts as a scaffold regulatory factor involved in skeletal gene expression

214(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR214)

TAZ

Stimulates osteoblast differentiation

RUNX2 co-activator

215(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR215)

TWIST

Inhibits osteoblast differentiation

Inhibits RUNX2

216(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR216)

Protein-coding gene

BGLAP

Regulates bone remodelling

Binds to apatite and calcium

217(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR217)

COL1A1

Stimulates osteoblast differentiation

Binds to calcium ion

218(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR218)

DKK1

Negative regulator of bone growth

Inhibits LRP5 or LRP6 interaction

219(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR219)

PTK2

Stimulates osteoblast differentiation

Integrin signal transduction

41(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR41),220(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR220)

SOST

Negative regulator of bone growth

Inhibition of canonical WNT signalling

221(https://www-nature-com-443.webvpn.cams.cn/articles/s41580-020-00279-w#ref-CR221)

在小鼠中的研究强调了SOX9作为成软骨作用必不可少的转录因子的重要性，这对于原骨细胞成骨至关重要。SOX9还通过激活软骨生成基因（例如Col2a1）来驱动软骨分化。发现由Sox9-/-和Sox9 + / +多能细胞组成的小鼠胚胎嵌合体在软骨浓缩物中仅包含Sox9 + / +细胞。此外，Sox9的缺失会干扰软骨分化并导致软骨标记物的表达失活，最终导致细胞死亡。

在人类中，SOX9基因座内的杂合突变导致早期致命的骨骼综合症的发展，这种综合症称为“campomelic dysplasia ”。患有campomelic dysplasia 的个体天生具有骨骼缺陷，例如小下颌/小颌畸形，侏儒症和其他骨骼畸形。通常，整个成年期SOX9的表达可以持续维持软骨和骨骼的发育。

RUNX2是驱动骨骼发育的转录因子（TAble 2）。RUNX2与核心结合因子亚基β结合形成异二聚体，该异二聚体调节成骨细胞基因的表达，例如编码骨桥蛋白（Spp1），骨唾液蛋白2（Ibsp）和骨钙素2（Bglap2）的基因。在小鼠中，Runx2在未成熟的成骨细胞中强烈表达，但在成熟的成骨细胞中表达水平降低。小鼠Runx2缺失导致成骨细胞完全缺失，Spp1，Ibsp和Bglap2不表达。因此，早期骨骼发育过程中的RUNX2活性对于成骨细胞的分化至关重要。

相比之下，RUNX2在成熟成骨细胞中的作用尚未得到充分了解，需要进一步研究。在成熟的成骨细胞启动子Col1a1下进行Runx2β基因敲除研究将导致矛盾的结果。外显子4中Runt结构域的缺失未导致表型变化，而外显子8缺失所导致Runx2的截短则导致骨骼形成减少。这些发现表明Runx2使成骨细胞保持未成熟状态，从而阻止了成骨细胞的成熟并完成了骨形成。此外，这些发现与观察到的成熟成骨细胞中Runx2表达的减少相一致。

OSX是成骨细胞转录因子，是正常骨骼发育所必需（TAble 2）。OSX触发未成熟的成骨细胞分化为成熟的成骨细胞，最终分化为骨细胞。在小鼠中，随着成骨细胞成熟过程中Osx表达的增加，Runx2表达同时减少。小鼠胚胎中Osx的缺失导致骨骼形成失败，并缺乏成骨细胞基因的表达，例如Sparc（编码骨连接蛋白）和Spp1。Osx的产后失活会导致骨骼形成紊乱，缺少小梁和更多的多孔皮质骨，异常的软骨蓄积和骨细胞功能障碍，以及骨细胞基因表达的减少，例如Sost和Dkk1的表达（表2）。

在经历软骨内骨化的骨骼中，未成熟的成骨细胞，破骨细胞和血管的不同细胞群能够侵入软骨原始基质。但是，如果没有OSX，就不会发生骨化。此外，在不表达Osx的情况下，膜状骨骼的浓缩间充质中的细胞不能分化为成骨细胞。即使没有Osx表达，Runx2表达仍存在于骨架形成细胞中。因此，OSX在RUNX2的下游起作用，表明在成骨细胞谱系中，RUNX2促进了未成熟的成骨细胞分化，而OSX是成熟的成骨细胞分化所必需。

ATF4是一种亮氨酸拉链，含有转录因子和cAMP反应元件结合蛋白（CREB）家族的一个组成部分。最初，ATF4被鉴定为富含成骨细胞的核结合蛋白，这是BGLAP2活化和成骨细胞终末分化所必需。ATF4突变会导致骨骼异常，例如与Coffin–Lowry综合征相关的骨量减少。此外，Atf4 +基因敲除小鼠模型表现出由于骨小梁延迟形成而导致的骨量和骨强度降低。该敲除模型为ATF4在成骨细胞分化和骨稳态中的作用提供支持。

ATF4对骨稳态的调节作用通过两种机制发生。首先，ATF4通过转录后修饰调节成骨细胞的分化，从而能够合成I型胶原蛋白，这是成骨细胞的重要作用。其次，ATF4通过与SATB2形成复合物，与RUNX2协同相互作用，增强转录因子的活性并促进成骨作用。而且，ATF4活性被抑制ATF4β介导的转录（FIAT）的因子所抑制。ATF4和FIAT（也称为TXLNG）在成骨细胞中表达。ATF4和FIAT之间的负反馈调节BGLAP2的激活：ATF4与骨钙素特定元件1结合，导致BGLAP2表达，并进一步扩展ATF4在骨稳态中的作用（表2）。

活化蛋白1（AP­1）转录因子复合物被认为是骨骼发育中的重要调节因子，特别是对于成骨细胞稳态（Table 2）。AP­1活性可以通过TGFβ，甲状旁腺激素和1,25­二羟基维生素D诱导。AP­1复合物由FOS，JUN和ATF家族的各种成员组成。编码这些转录因子的基因突变导致骨骼缺陷。具体而言，由于成骨细胞缺陷，Junb突变导致骨质减少。但是，Jund中的突变会导致骨骼形成增加而骨骼质量增加。此外，AP­1复合物优先与Runx2启动子中的成骨细胞特异性增强子Ce1结合。例如，AP­1复合物中的Fosb与Ce1结合，而天然存在的Fosb短异构体ΔFosb由于成骨细胞分化的增加而导致了骨硬化的发展。由FOS靶基因Fosl1编码的FOS­相关抗原1（FRA1）的过表达也导致骨硬化。FRA1表达的增加加速了成骨祖细胞向成骨细胞的分化，从而导致活性成骨细胞数量增加。因此，AP­-1复合物中JUN，FOS和ATF因子的调节功能可调节成骨细胞在骨形成和体内稳态中的活性。

成骨细胞谱系的分化（之前讨论过）受多种信号通路调节（图4）。尽管本节将单独讨论信号传导途径，但是这些途径以协调的方式起作用，以确保适当的骨骼发育和修复。

图4 调节成骨细胞分化的发育信号通路

1980年，HH被确认为在果蝇中身体各个节段的前部和后部发育之间产生差异的重要基因。并且已经证明，HH对人体前后轴的控制包括哺乳动物在内的多个物种中都得到了保留。

HH是一种分泌蛋白，通过旁分泌信号传导机制充当细胞形态发生素。该途径由SHH，IHH和DHH这三个同源物组成，其中SHH途径研究得最好。PTCH1和SMO是跨膜蛋白，是HH信号通路的受体。在没有HH的情况下，PTCH抑制SMO。当HH与PTCH结合时，其对SMO的抑制作用被消除，从而激活下游转录基因靶标，例如转录因子的GLI家族（图4a）。

在肢体发育中，SHH在发育中的肢芽的前后模式中起着重要的形态发生的作用。除了SHH本身，SHH信号传导的转录因子靶标GLI2和GLI3对于正常骨骼发育也是必需的。缺少Gli2或Gli3会导致小鼠骨骼发育异常和胚胎致死率；GLI1对于骨骼发育不是必需的，但是在成骨过程中确实与GLI2和GLI3协同作用。在体外系统中，Gli1的过表达上调了早期成骨相关基因如Runx2和Osx的转录。

除了在发育中的重要性外，HH通路在软骨内骨化过程中的骨形成中也起着至关重要的作用。成骨细胞的分化需要通过HH信号调节Gli1或Gli2。此外，在缺乏IHH信号的情况下，成骨细胞的分化会丢失，从而导致软骨内骨化不完全和随后的骨形成不完全。具体而言，IHH信号的下调会降低小鼠SSC的成骨细胞分化潜能，从而进一步导致骨折愈合不良。此外，微阵列分析表明在股骨骨折愈合的最初3天中，小鼠BCSP中Ptch1的表达上调。因此，HH信号对于小鼠SSC的成骨细胞分化非常重要，使细胞能够进行软骨内骨化和修复骨骼。出生后，成骨细胞表达IHH，转录靶标GLI2在激活成骨细胞特异性基因中起关键作用。HH信号转导靶向转录因子GLI2的激活，后者又激活成骨细胞分化的主要调控因子RUNX2。

此外，HH信号传导与WNT和BMP途径相互作用以调节骨形成。在HH信号下游需要WNT通路来调节成骨细胞的分化；另外，HH信号转导需要β1连环蛋白的存在。最后，HH信号在软骨内骨化过程中与BMP途径相互作用。BMP途径在HH信号传导的下游起作用，以调节成骨细胞从软骨膜细胞的分化。

Notch信号传导需要细胞与细胞直接接触。细胞上表达的Notch受体（NOTCH1，NOTCH2，NOTCH3和NOTCH4）与Jagged（JAG1和JAG2）和Delta（DLL1，DLL3和DLL4）家族相互作用，以启动细胞内信号传导。这种结合在PS1或PS2的帮助下导致γ分泌酶复合物的蛋白水解切割，从而释放出Notch细胞内结构域（NCID）。该结构域易位至细胞核以与Hairless LAG2家族转录因子RBPJ相互作用，从而引发Mastermind样蛋白1（MAML1）激活复合物。激活物复合物诱导Notch目标基因的表达，包括编码与YRPW基序（HEY）相关的HES和HES（图4b）。

小鼠的遗传研究表明，Notch信号在骨骼发育过程中的重要性。在Prrx1Cre小鼠中，发育中的肢芽中PS1，NOTCH1和NOTCH2的失活导致生长板中肥大软骨细胞的数量增加，从而导致小梁骨增加。Notch增强成骨细胞谱系的细胞复制并抑制成骨细胞分化。作用机理的可能解释是继RUNX2功能抑制之后的效应。NCID可以直接与Runx2相互作用并抑制Bglap2的反式激活。HES和HEY蛋白也抑制RUNX2功能。在成骨细胞特异性启动子（Osx）下Notch1表达的增加阻碍了成骨细胞谱系细胞分化为专门的成骨细胞，从而导致小鼠骨质减少。相反，在Osx启动子的控制下，Notch1和Notch2的失活导致成熟成骨细胞数量增加和松质骨体积增加。这些研究表明Notch信号在成骨细胞谱系分化中的重要性。

最后，Notch信号通路已显示在下颌骨牵张后在小鼠SSC中上调。基于先前关于Notch信号传导和成骨细胞分化的研究的一种假设认为,Notch信号传导对损伤的上调可能使小鼠SSC复制并确保成骨细胞分化之前存在适当数量的成骨祖细胞用于骨修复。然而，需要更多的研究来确定Notch信号和SSC之间的关系。

WNT配体通过附着于细胞表面受体进行交流，从而引发细胞内信号传导级联反应。经典的WNT途径的特征在于WNT配体通过与受体Frizzled和低密度脂蛋白受体相关蛋白5（LRP5）或LRP6结合而使β catenin在WNT配体激活时的稳定作用。WNT配体的结合导致β1连环蛋白在细胞质中积聚，从而使其能够移位至细胞核。在细胞核中，β1连环蛋白与T细胞因子（TCF）/淋巴增强因子（LEF）结合以刺激转录活性（图4c）。

导致LRP5功能丧失的突变会导致骨量低和骨质疏松-假性神经胶质瘤综合征的发展，这是一种以骨质疏松和眼睛异常为特征的常染色体隐性遗传疾病。相比之下，增加LRP5功能的突变与人类骨量增加有关。尽管尚未完全阐明LRP5（或LRP6）和WNT配体调节骨量的机制，但都需要这两种成分来刺激成骨细胞增殖和成骨细胞成熟。当将纯化的WNT3A的脂质体囊泡递送到小鼠的骨折部位时，由于成骨细胞谱系细胞的增殖增加和较早分化，因此发生了快速愈合。

WNT拮抗剂在损伤后的小鼠SSC和下游祖细胞中被上调，这可能是为了确保在骨修复过程中成骨细胞分化的正确时机。例如，小鼠BCSP的微阵列分析显示股骨骨折3天后WNT拮抗剂DKK1的表达增加。然而，DKK1在损伤后7天被下调，表明WNT信号转导小鼠SSC成骨细胞的时限性。此外，在正常条件下，编码硬化蛋白并在人SSC中上调的SOST与LRP结合，抑制受体和WNT活性。因此，SOST通过对抗LRP激活的作用来确保骨骼不会过度生长，从而成为骨骼形成的负调节剂。Lrp5基因的错义突变会导致该受体对硬化素和DKK1的结合亲和力低，从而导致小鼠表现出与已知人类疾病相似的表型，即常染色体显性高骨量。Lrp5基因在小鼠中的敲除导致骨量减少，让人联想到人骨质疏松症的表型。此外，Lrp5-/-小鼠中Lrp6的单倍剂量不足会导致骨量减少。Lrp5­基因敲除小鼠的较低骨量归因于骨形成的减少，而Lrp6亚型小鼠的较低骨量归因于骨吸收的增加。

最后，经典的WNT信号通路在与其他信号通路相互作用中具有重要作用。Notch途径的激活抑制了经典的WNT途径，从而阻止了成骨细胞的分化。如前所述，Notch途径的激活可增加骨祖细胞的增殖，同时抑制分化为成熟的成骨细胞。但是，经典的WNT途径使成骨细胞谱系细胞发展为最终的定型成骨细胞。因此，Notch信号和经典WNT信号之间的平衡决定了谱系细胞对成骨细胞的依赖性。另外，BMP信号转导补充了WNT osteo诱导的成骨分化，因为这两个信号转导通路共享共同的靶标，例如结缔组织生长因子。例如，在存在WNT3A和BMP9的情况下，成骨作用增强。此外，BMP2对异位骨形成的诱导通过Dkk1过表达和Ctnnb1（编码β­ catenin）的条件性敲除而被拮抗。此外，BMP2可能通过增加Lrp5的表达和稳定β-catenin促进成骨分化。

TGFß家族由大量结构相似的蛋白质组成。TGFß是一种多功能肽，可调节细胞过程，例如增殖和分化。这些蛋白质形成TGFβ复合物，与细胞表面的丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶受体相互作用。随后的细胞内信号通过SMAD蛋白传播，最终导致靶基因表达发生变化。TGFβ超家族包含TGFβ亚家族，激活素亚家族和BMP。具体而言，已显示BMP2和BMP4在成骨细胞分化中必不可少（图4d）。

BMP与位于细胞表面的BMP受体（BMPR）结合。BMPR是属于丝氨酸/苏氨酸激酶家族的跨膜蛋白，该蛋白由1型受体和2型受体组成。BMP和BMPR之间的相互作用使复合物稳定，导致2型受体磷酸化1型受体。磷酸化的1型受体通过受体调节的SMAD家族蛋白（SMAD1，SMAD5和SMAD8）的磷酸化导致细胞内信号的传播。磷酸化的SMAD蛋白与SMAD4相互作用，SMAD4包含一个核输入序列，使该蛋白能够定位于细胞核并调节基因表达。

遗传研究已确定Bmp2通过靶向Runx2下游来促进成骨细胞分化。敲除Bmp2导致发育缺陷，影响出生前后骨骼的形成。具体而言，在Bmp2 +基因敲除小鼠中，骨量和小梁明显减少。研究表明，仅Bmp2的丢失并不能阻止肢体成骨细胞的分化。但是，组合敲除Bmp2和Bmp4或Bmp2和Bmp7会导致异常的成骨细胞分化。尽管Bmp2对于发育过程中成骨细胞的形成可能是必不可少的，但它是骨折修复所必需。在愈合期间，Bmp2β缺陷型小鼠的Runx2，Osx，Bglap2和Col1a1基因表达水平较低，这些基因通常在骨骼形成和修复过程中被上调。下颌骨折后，小鼠SSC中Bmp2和Smad3均上调。基因调控的改变支持BMP信号转导和SMAD蛋白信号转导对成骨细胞分化和随后的骨修复的必要性。此外，对Bmp2在小鼠SSC及其下游祖细胞中的转录表达进行分析的结果显示，从小鼠SSC到定型成骨细胞，Bmp2表达均下降，且无任何先期损伤。

由于BMP信号级联包含许多组分，另一个需要调节BMP信号的目标是BMPR 1A型（BMPR1A；也称为ALK3）。BMPR1A存在于成骨细胞和成骨细胞上，而组成型活性Bmpr1a已显示在细胞分化中起作用。在成骨细胞的背景下，已显示Bmpr1a在限制成骨细胞增殖同时刺激成骨细胞活性方面具有双重作用。通过删除Bmpr1a，观察到小梁骨形成的增加，这是由于前成骨细胞过度增殖导致成骨细胞数量增加所致。此外，BMPR1A在确定骨骼的机械特性方面具有关键作用。受体的存在对于骨骼质量和机械完整性至关重要，因为它会导致成骨细胞中胶原蛋白交联成熟度增加。

成纤维细胞生长因子（FGFs）是一类细胞信号蛋白，对于正常发育至关重要。生长因子激活细胞表面受体被称为“成纤维细胞生长因子受体”（FGFRs）。FGF与FGFR的胞外配体结合域的结合导致FGFR胞内域中酪氨酸残基的磷酸化。随后，这种磷酸化作用导致下游信号通路的激活，如Ras-MAPK，磷酸肌醇3β激酶-AKT和蛋白激酶C通路。FGF信号传导涉及正常发育的关键要素，例如中胚层诱导，神经发育和肢体发育。FGF2在发育中的肢芽中表达，并有助于肢体生长和塑型。人FGF2在小鼠中的过度表达会导致侏儒症，使长骨变短和变平。小鼠中Fgf2的缺失导致骨量减少，骨形成和骨矿化减少（图4e）。

除了FGF2，FGF8和FGF10都在肢体发育中起作用。有针对性的Fgf8缺失导致小鼠肢体发育失败，肢体芽大小明显减少，骨骼元件发育不全。FGF8和FGF10之间存在正反馈回路，这对于肢体发育至关重要。与小鼠Fgf8缺失相似，Fgf10­基因敲除小鼠完全缺乏前肢和后肢发育。这些小鼠的肢芽萌芽仍然发生，但是肢芽芽的生长受到损害。FGF8也表达在成骨细胞中，特别是在颅骨的皮质骨中。向骨细胞培养基中添加FGF8会导致细胞分化为成骨细胞并增加体外骨形成。下颌牵张后，Fgf8表达在愈合过程中增加。最初，小鼠SSC中的Fgf8表达上调；然而，随着细胞分化为成骨细胞，Fgf8表达被下调。因此，FGF8可能调节细胞分化为成骨细胞的能力及其随后的成骨活性。

除了了解FGF在骨骼发育和体内稳态中的作用外，阐明FGFR在这些相同背景下的作用还可以进一步了解信号通路的作用。FGFR1在肢体发育中具有重要作用。在肢体间充质增厚之前，发育早期小鼠中FGFR1的破坏会导致严重的缺陷，其特征是根尖外胚层脊畸形。在条件性Fgfr1 +基因敲除小鼠中，Fgfr1的破坏可以被暂时控制并限制在发育的后期，尽管功能性阑尾骨架和前肢和后肢畸形，但小鼠的表现却有所减弱。FGFR1还充当长骨生长的负调节剂。由于软骨内骨化过程中肥大软骨细胞的延迟降解或成熟，有条件地删除骨软骨生成器细胞谱系中的Fgfr1导致了肥大区域的高度增加。此外，小鼠Fgfr1缺失研究显示成骨细胞增殖增加，分化和基质矿化延迟。最后，在下颌牵张后的愈合过程中，Fgfr1表达增加。Fgfr1表达在小鼠SSC中下调；然而，随着细胞发育为成骨细胞，表达水平增加。因此，成骨细胞谱系中Fgfr1表达的增加进一步表明受体在分化和基质矿化以形成骨中的重要性。

FGFR2是FGF信号通路中调节肢体发育的另一个重要受体。FGFR2在早期肢芽的紧密间充质中表达，表达局限于长骨和颅缝的软骨膜组织和骨膜组织。FGFR2跨膜结构域的选择性去除导致小鼠胚胎致死性。具体地说，结构域III的缺失导致突变体胚胎无法形成肢芽，表明Fgfr2域III对于肢体启动至关重要。FGFR2在颅缝发育中的作用已产生了多种功能突变小鼠模型。一种模型是Fgfr2 + / S252W小鼠，它会发展出颅缝骨化早闭综合征，类似于人的Apert综合征。该模型阐明了FGFR2在与Apert综合征相关的异常成骨细胞增殖和分化中的作用。其他突变小鼠模型，例如Fgfr2-/-小鼠，由于成骨细胞的分化和矿化减少，显示出头骨穹顶的分化和矿化延迟以及冠状缝线过早形成。此外，这些观察结果与成骨细胞标志物骨桥蛋白和RUNX2的表达降低有关。

骨修复过程中的成骨细胞功能取决于环境生态位细胞的信号。生态位细胞提供特定的微环境，并根据生物体的需要整合信号以介导适当的干细胞反应。生态位与骨祖细胞相互作用，以在稳态过程中保持其未分化的特性。但是，在骨头受伤后，变化的生态位环境导致前体细胞分化为成骨细胞并修复受损的组织。因此，要了解成骨细胞的分子调控使其能够发挥其在骨修复中的功能，必须了解生态位细胞（如炎性细胞，内皮细胞和雪旺氏细胞）的影响。

急性骨损伤后，炎症细胞被激活，导致血肿引发的级联反应（来自骨内部和周围软组织破裂的血管）。血肿以缺氧和低pH为特征，可作为临时支架，使局部组织巨噬细胞和多形核中性粒细胞主动浸润。具体而言，在骨折愈合中，骨膜和骨膜表面的常驻巨噬细胞群在膜内骨化中起关键作用，而募集的炎性巨噬细胞在软骨内骨化中起重要作用。这些炎性细胞的流入导致趋化因子例如IL6和趋化因子配体2（CCL2）的分泌。BMP4和VEGF与这些促炎性趋化因子一起在急性骨损伤部位释放到微环境中。分泌的因子BMP4，VEGF，IL6和CCL2通过与新生的骨祖细胞相互作用来促进成骨分化，并分化为成骨细胞谱系以进行骨修复。

血管重建对于骨骼修复至关重要，因为新的脉管系统将营养带到了损伤部位。这些血管由内皮细胞组成，这些内皮细胞与骨祖细胞相互作用以产生支持成骨细胞谱系命运规范的微环境。成骨作用与毛细血管内皮细胞亚型H型内皮细胞有关。H型细胞存在于产后长骨的干骺端和内膜。这些细胞表达PECAM1和内粘蛋白，它们是内皮细胞表面的关键标志物。除了促进血管生成，H型细胞还提供通过Notch信号通路靶向骨祖细胞的分子信号。内皮Notch信号传导调节成骨作用，这一发现表明，Notch信号通路的破坏降低了总体成骨作用。在分子水平上，内皮Notch信号转导降低Spp1，Runx2和Osx的表达。综合这些发现，内皮细胞介导的Notch信号改变了损伤部位的生态位，使骨祖细胞分化为成骨细胞。

感觉神经和交感神经在骨骼稳态和骨骼修复中起着至关重要的作用。神经生长因子（NGF）是一种神经营养蛋白，参与感觉和交感神经的发育，维持和再生。在体内研究中，在兔下颌骨中应用了牵引成骨法;由于下牙槽神经贯穿下颌骨，因此该骨骼是独特的。NGF的外源应用减少了该模型中骨修复的巩固期。因此，神经在骨龛中天然分泌的NGF的存在促进了成骨。此外，下颌骨牵张成骨模型发现在骨修复期间NGF和VEGF表达升高。NGF由神经中的细胞表达，而VEGF由Schwann细胞表达。综合这些发现，骨龛中神经细胞和雪旺细胞的存在支持了骨祖细胞的成骨分化，从而导致了新的骨形成。总的来说，成骨细胞谱系的确定取决于适当的位置，以提供必要的信号来诱导血管生成并最终形成骨基质以形成新的骨骼。

骨骼修复中骨骼生物学的失调发生在从“缺骨”到“过度骨骼”的频谱上，以“正常骨骼”的恢复为中点（图5）。迄今为止，本综述已经讨论了体内平衡过程中正常骨骼的发育和维持。然而，在这个连续过程中可以发现许多临床骨疾病。当愈合过程中断时，会发生骨折不愈合的现象，即长骨骨折，从而导致骨间隙内的骨形成不足。为了减少骨愈合不连的发生，临床医生使用了重组人BMP2，使胫骨骨折的愈合率为86.6％。重组人FGF2的安全性和功效分析已显示出对胫骨骨折愈合的有益作用。但是，临床研究并未显示治疗组和对照组之间的治愈率有任何显着提高。

愈合过程中另一个例子是老年人跌倒引起的髋部骨折。在全球范围内，每年发生170万例髋部骨折，由于人口老龄化，到2050年，这一数字预计将增加到600万以上。老年人的大多数髋部骨折继发于潜在的骨质疏松症。

最后一个例子是单皮质缺损，其经常发生在儿童中。在美国，Greenstick骨折占所有儿科急诊科就诊的12％。这种骨折类型的临床干预措施是使用石膏固定骨骼，使其自然愈合。由于骨折仍保留骨骼的形状，并且儿童的再生潜力很强，因此骨折可以随着时间的流逝而迅速愈合，而对受影响的骨的应力却很小。

图5 骨骼疾病

相反情况是“过多的骨形成”，例如异位骨化。异位骨化定义为异位（骨骼外）骨形成，其可在软组织损伤（例如外伤，烧伤或脊髓损伤）后发生。已经表明这种异位骨形成需要先天免疫应答，特别是巨噬细胞的应答，巨噬细胞在这种情况下会刺激软骨原性和促成骨基因并激活成骨祖细胞。炎性反应激活嗜中性粒细胞和巨噬细胞，它们分泌促软骨因子（例如TGFβ1）和促骨性因子（例如制瘤素M），从而驱动组织中的祖细胞分化为软骨细胞。炎性反应诱导了包括IL6和VEGF在内的细胞因子级联反应，已知这些因子可促进血管生成以及经典和非经典BMP信号传导，如前所述。除减少创伤性异位骨化外，已证明消除巨噬细胞可减少骨折愈合中愈伤组织的形成。

鉴定引起非遗传性异位骨化的细胞谱系具有重要意义。谱系追踪分析已鉴定出Prx1Cre和ScxCre谱系的组织驻留细胞，这些细胞标记了推测的异位骨化祖细胞。已显示可标记异位骨化祖细胞的其他Cre等位基因包括PdgfraCre和Gli1Cre。仅有少量的异位骨化显示与BCSP一致的标记。与骨折愈合相似，经典的BMP和TGFβ信号也是异位骨化形成的关键，并且是潜在的治疗目标。

另外，与骨折修复相似，机械转导信号和细胞外基质特性（如胶原蛋白排列）已显示出改变细胞命运的能力。了解异位骨化中导致异常细胞命运的细胞和途径可能会为其他疾病过程（例如肌肉纤维化）提供信息，并可以改善针对骨修复的靶向疗法。与骨骼的发育和修复相似，异位骨化的形成也存在基于年龄和性别的差异。总体而言，当关键途径或分子失调时，临床骨疾病可提供有关骨生物学调节以及对骨稳态的后果见解。

通过鉴定骨形成所必需的特定细胞和分子成分，对成骨细胞谱系的了解已大大增加。通过在生长板中应用高细胞活性的生理意义以及使用细胞分选技术，已经分离出了干细胞群体（SSCs），通过对SSC的高通量测序研究，已显示特定基因和染色质可及性模序被上调，包括Runx2，Ihh和Fak（也称为Ptk2）。这一新颖的遗传学信息提供了对在稳态中维持SSC以及在损伤诱导的再生反应中激活细胞群所必需的途径的见解。即使在该领域取得了长足的进步，仍需要进行更多的研究以进一步了解成骨细胞谱系在骨骼发育和修复中的作用和调控。

首先，需要在骨骼发育和疾病的背景下确定SSC和MSC之间的关系或缺乏关系。两种细胞类型均显示出成骨细胞和软骨细胞。但是，需要进行进一步的研究以确定MSC和SSC是否是单独的亚群，或者一种细胞类型是否是另一种细胞类型的子集。了解这种关系将调和成骨细胞祖细胞起源领域的各种观点。当前，已知各种发育信号传导途径对于适当的肢体形成是必需的。然而，需要进行进一步的研究以确定这些信号传导相互作用，尤其是确定将多能细胞赋予成骨细胞谱系的特定基因。最后，还需要进行其他研究以确定引导干细胞向成骨细胞分化的可能治疗作用。通过了解分化途径和成骨细胞分化关键转录因子的细微差别，可以设计出治疗方法，其中临床医生可以利用受伤骨中的内源性SSC和/或MSC来驱动成骨细胞分化，从而促进骨修复。研究成骨细胞谱系的潜力是巨大的。在应用新技术回答这些基本问题的推动下，对成骨细胞谱系的进一步了解可以使科学和临床实践受益。

参考文献

Salhotra A, Shah HN, Levi B, Longaker MT. Mechanisms of bone development and repair. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020 Sep 8. doi: 10.1038/s41580-020-00279-w. Epub ahead of print. PMID: 32901139.