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图13：NF-κB p65 WB实验结果图，Anti- Anti-NF-kB p65抗体[E379] （ab32536）。 一抗：使用Anti- Anti-NF-kB p65抗体[E379]一抗，浓度1/1000稀释。 泳道1：Raw264.7全细胞裂解液； 泳道2：1ug/ml lipopolysaccharides处理6h的Raw264.7全细胞裂解液； 泳道3：小鼠大脑组织裂解液； 泳道4：小鼠脾脏组织裂解； 二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L （HRP） （ab97051）二抗，浓度1/20000稀释。 预测条带大小：65 kDa
图14：NF-κB p65 WB实验结果图，Anti- NF-kB p65抗体[EP2161Y] （PE） （ab76311）。 一抗：使用Anti- NF-kB p65抗体[EP2161Y] （PE）一抗，浓度1/1000稀释。 泳道1：野生型HAP1全细胞裂解液； 泳道2：敲除NF-kB p65的HAP全细胞裂解液； 泳道3：HeLa全细胞裂解液； 泳道4：A431全细胞裂解液 二抗：使用Goat anti-Rabbit IgG H&L （IRDye® 800CW） preadsorbed （ab216773）二抗，浓度1/10000稀释。 预测条带大小：60 kDa 检测条带大小：70 kDa 2. p65蛋白磷酸化修饰形式总是检测不到是怎么回事？在WB实验中的注意事项有哪些？（来源于国内某高校客户提问）p65靶点特性： NF-κB p65的翻译后修饰可能需要条件诱导，例如Calyculin A和TNF-a刺激细胞后，可检测到536位丝氨酸被磷酸化修饰的NF-κB p65蛋白。 使用新鲜制备的样本，防止冻存样本导致磷酸化修饰减弱。进行磷酸化修饰检测时，请先确认细胞内NF-κB p65总蛋白的含量。 NF-κB p65蛋白有很多位点可能发生磷酸化修饰，请根据文献中诱导刺激后发生磷酸化修饰的确切位点，选择合适的抗体，推荐设置阳性对照。
图15：phospho NF-κB p65 WB实验结果图，Anti-NF-kB p65 （phospho S536）抗体[EP2294Y] （ab76302） 。 一抗：使用Anti-NF-kB p65（phospho S536）抗体[EP2294Y]一抗，浓度1/1000稀释。 泳道1：HeLa全细胞裂解液； 泳道2：Calyculin A和TNF-alpha处理后的HeLa全细胞裂解液 二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L （HRP） （ab97051）二抗，浓度1/20000稀释。 预测条带大小：65 kDa 检测条带大小：65 kDa
图16：phospho NF-κB p65 WB实验结果图，Anti-NF-kB p65 （phospho S276）抗体[EPR17622] （ab183559）。 一抗：使用Anti-NF-kB p65（phospho S276）抗体[EPR17622]一抗，浓度1/1000稀释。 泳道1：HeLa全细胞裂解液； 泳道2：100ng/ml Calyculin A（ab141784）处理30分钟，20ng/ml TNF-a处理5分钟的HeLa全细胞裂解液；泳道3：100ng/ml Calyculin A（ab141784）处理30分钟，20ng/ml TNF-a处理5分钟，然后碱性磷酸酶处理1小时后的HeLa全细胞裂解液 二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L （HRP） （ab97051）二抗，浓度1/100000稀释。 预测条带大小：60 kDa 检测条带大小：80 kDa WB实验需特别关注小细节： 样本制备： 添加复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。对于磷酸化修饰蛋白需添加足量磷酸酶抑制剂，防止靶标蛋白被去磷酸化。对于乙酰化修饰蛋白需添加足量去乙酰酶抑制剂，防止靶标蛋白被去乙酰化。整个样本制备过程中，保持样本置于冰上。通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。电泳： 至少上样20μg总蛋白进行电泳。转膜： 建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功。建议不要裁膜，保留全膜或至少 50-100 kDa部分膜来孵育此抗体。3. 小鼠脑组织p62蛋白如何提取，才不会被降解？在WB实验明显检测到。（来源于哈尔滨医科大学某客户提问）SQSTM1/p62是泛素化相关蛋白，容易降解，在WB实验中易出现无信号、拖带现象。推荐制备新鲜裂解液，当天完成样品制备和跑胶。 由于组织相对于细胞样本成分更多、更复杂，在制备SQSTM1/p62的蛋白裂解液可以尝试加入MG-132（ab141003），例如HeLa细胞+MG-132（10 µM 4h）+RIPA，防止一定程度的蛋白降解，获得单一条带。
图17：SQSTM1/p62 WB实验结果图，Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR18351] （ab207305）。 一抗：使用Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR18351]一抗，浓度1/1000稀释。 泳道1：HCT116全细胞裂解液； 泳道2：SQSTM1 CRISPR/Cas9 edited HCT116全细胞裂解液； 泳道3：HepG2全细胞裂解液； 泳道4：HeLa全细胞裂解液 二抗：使用Goat anti-Rabbit IgG H&L （IRDye® 800CW） preadsorbed （ab216773）二抗，浓度1/10000稀释。 预测条带大小：47 kDa 检测条带大小：55 kDa
图18：SQSTM1/p62 WB实验结果图，Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker （ab109012） 。 一抗：使用Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844]一抗，浓度1/1000稀释。 泳道1：MCF7 全细胞裂解液； 泳道2：小鼠大脑组织裂解液； 泳道3：大鼠大脑组织裂解液； 泳道4：小鼠肺组织裂解液； 泳道5：大鼠肺组织裂解液； 泳道6：小鼠心脏组织裂解液； 泳道7：大鼠心脏组织裂解液 二抗：使用Anti-Rabbit IgG H&L （HRP） （ab97051）二抗，浓度1/20000稀释。 检测条带大小：62 kDa WB实验需特别关注小细节： 样本制备： 使用新鲜制备的裂解液。添加足够量的复合蛋白酶抑制剂以避免靶标蛋白降解。超声破碎样本，以获得更多的靶标蛋白。整个样本制备过程中尽量在冰浴进行，以防止蛋白降解。通过Bradford分析、Lowry分析或BCA分析测定样本总蛋白浓度。电泳： 至少上样20μg总蛋白进行电泳。封闭： 延长封闭时间，考虑更换合适的封闭剂。Abcam推荐5%脱脂奶粉，3%BSA或血清封闭30分钟。这些可包含在抗体缓冲液中。转膜： 强烈建议转膜完成后使用丽春红染色，确定转膜是否成功。一抗孵育： 稀释一抗至合适浓度，以更高稀释度抗体孵育更长时间（耗时长但特异性结合最好。）4℃孵育。4. p62 及相关 LC3 结合蛋白检测时有哪些地方需要注意？（来自医院某客户提问）SQSTM1/p62 是 LC3 和泛素化底物之间的连接物，可被自噬有效降解。因此，SQSTM1/p62 蛋白的水平可用于监测自噬流。 一般认为 SQSTM1/p62 量与自噬活性呈负相关。免疫细胞化学实验里 SQSTM1/p62 阳性内容物的累积或 western blot 实验中 p62 水平的升高经常被视作自噬受阻的标志。 尽管细胞 SQSTM1/p62 水平与自噬流的其他标志物的测定相关性很好，但仍要注意以下几点： 自噬和泛素-蛋白酶体系统都可降解 SQSTM1/p62，当蛋白酶体受到抑制时，其水平可能会升高。除 LC3 外，SQSTM1/p62 还包含与多个信号分子相互作用的结构域，表明 SQSTM1/p62在自噬中可能具有其他功能。由于过表达 SQSTM1/p62 会使该蛋白倾向于自我聚集，并且可能不再代表自噬活性，所以有必要检查内源性 SQSTM1/p62。SQSTM1/p62 在特定情况下会被转录上调。SQSTM1/p62 水平的检测必须结合其他方法一起评估，如 LC3-II 周转。 SQSTM1/p62 聚集体不溶于 NP40 或 Triton X-100 裂解环境。因此，为了最后确定自噬导致的 SQSTM1/p62 降解，利用自噬诱导剂或自噬抑制剂处理后，Triton X-100 可溶性和不溶性组分中的 SQSTM1/p62 水平均需测定。 5. 在进行WB检测时，为什么很难检测到Nrf2呢？（来源于某研究所客户提问）（来源于某研究所客户提问）在正常情况下，Nrf2会被泛素化修饰并在细胞质中降解， WB中难以检测。 氧化应激反应，亲电试剂，化学激活剂和自噬会导致NFE2L2/NRF2在细胞核内聚集，所以适当的样本刺激处理对于WB实验的成功至关重要。 6. Nrf2的预测分子量约68 kD，但实际实验和文献中的目的条带往往在100-110 kD（经过敲低/过表验证），这是什么原因造成的呢？建议以哪个大小的条带为准？（来源于华中科技大学某客户提问）由于Nrf2 存在异构体及翻译后修饰，所以在 WB 实验中，检测到的Nrf2的分子量大小并非完全与预测的68 kDa一致。为确认目的条带，建议WB实验使用以下推荐的阳性对照： 2 µM MG-132处理18小时的HeLa或HepG2全细胞裂解液25 µM MG-132处理4小时的HCT 116全细胞裂解液30 µM tBHQ处理4小时的MDA-MB-231细胞核裂解液人源重组Nrf2蛋白（ab132356）
图19：Nrf2 WB实验结果，Anti-Nrf2 antibody [EP1808Y] - ChIP Grade （ab62352）。 一抗：使用Anti-Nrf2 antibody [EP1808Y]，浓度1/1000稀释。 泳道1：HeLa全细胞裂解液； 泳道2：2 µM MG-132处理18小时的HeLa全细胞裂解液；泳道3：Saos-2全细胞裂解液；泳道4：THP-1全细胞裂解液 二抗：使用Goat Anti-Rabbit IgG H&L （HRP） （ab97051） ab97051，浓度1/20000稀释。 预测条带大小：68 kDa 检测条带大小：100 kDa 1. 来自中山大学附属肿瘤医院以及福建中医药大学某客户针对Nrf2的实验优化建议个人经验分享，仅供大家参考。 Nrf2经蛋白酶体途径降解，可以加蛋白酶体的抑制剂处理的样本作为对照。Nrf2可能入核，需要用较强的蛋白裂解液裂解细胞。尽量做到蛋白现提现用，一次少提点，尽快用完，很容易降解。参考文献：Levine B, Kroemer G. Autophagy in the pathogenesis of disease. Cell. (2008) 132(1) :27-42.Augustine M K Choi , Stefan W Ryter, Beth. Autophagy in human health and disease. N Engl J Med. (2013) 368(7): 1845-1846.Paul N Moynagh. The NF-kappaB pathway. J Cell Sci. (2005) 118(Pt 20):4589-4592.A Hoffmann, G Natoli, G Ghosh. Transcriptional regulation via the NF-kappaB signaling module. Oncogene. (2006) 25(51):6706-6716.Bo-Hwa Choi, Da-Hyun Lee, Jin Kim et al. Controls of nuclear factor-kappa B signaling activity by 5'-AMP-activated protein kinase activation with examples in human bladder cancer cells. Int Neurourol J. (2016) 20(3):182-187.G Filomeni, D De Zio, F Cecconi. Oxidative stress and autophagy: the clash between damage and metabolic needs. Cell Death Differ. (2015) 22(3):377-388.Jorge Moscat, Michael Karin , Maria T Diaz-Meco. p62 in cancer: signaling adaptor beyond autophagy. Cell. (2016) 167(3):606-609.YouJin Lee, Tsui-Fen Chou, Sara K Pittman, et al. Keap1/Cullin3 modulates p62/SQSTM1 activity via UBA domain ubiquitination. Cell Rep. (2017) 19(1): 188-202.Zhao-Yang Zhang , Sen Guo , Rui Zhao et al. Clinical significance of SQSTM1/P62 and nuclear factor-κB expression in pancreatic carcinoma. World J Gastrointest Oncol.(2020) 12(7): 719-731.Jiao Yang, Hong Peng, Yumin Xu et al. SQSTM1/p62 (sequestosome 1) senses cellular ubiquitin stress through E2-mediated ubiquitination. Autophagy. (2018) 14(6): 1072-1073.Alexa Parousis, Heather N Carter , Claudia Tran Parousis et al. Contractile activity attenuates autophagy suppression and reverses mitochondrial defects in skeletal muscle cells. Autophagy. (2018) 14(11):1886-1897.H C Huang, T Nguyen, C B Pickett et al. Regulation of the antioxidant response element by protein kinase C-mediated phosphorylation of NF-E2-related factor 2. Proc Natl Acad Sci U S A.(2000) 97(23):12475-12480.Viraj R Sanghvi, Josef Leibold, Marco Mina et al. The oncogenic action of Nrf2 depends on de-glycation by fructosamine-3-kinase. Cell. (2019) 178(4):807-819.P Moi, K Chan, I Asunis et al. Isolation of NF-E2-related factor 2 (Nrf2), a NF-E2-like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NF-E2/AP1 repeat of the beta-globin locus control region. Proc Natl Acad Sci U S A.(1994) 91(21):9926-9930.Feng He , Xiaoli Ru , Tao Wen. NRF2, a transcription factor for stress response and beyond. (2020) 21(13):4777.Matthew Dodson, Montserrat Rojo de la Vega, Aram B Cholanians et al. Modulating Nrf2 in disease: timing is everything. (2019) 59:555-575. |
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