时间分辨荧光免疫分析原理（图）

2、镧系复合物荧光机理

镧系（lanthanide）元素包括15种元素，大多以氧化态存在，且性质相似，共生在同一矿物中，很难进行分离和提纯。镧系元素具有特殊的物理、化学性质，因此镧系元素和其化合物有广泛的应用价值。目前镧系元素及其化合物已成为现代尖端科学技术不可缺少的特殊材料。例如超导材料、电子材料、合金材料等。镧系元素中Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+可发荧光，可以在荧光免疫分析中使用。镧系复合物中，镧系离子的电子跃迁，主要来自三方面：f—f、4f—5d、电荷跃迁。Sm3+、Eu3+、Tb3+和Dy3+等属于f—f跃迁，所以这些离子本身所吸收的能量和发射的荧光强度是很低的，在分析中很难利用。它们通常需结合一个有机复合物（螯合物，Chelate），作为媒介使能量向离子转移。

镧系复合物（lanthanide complex）发射荧光与常规的荧光团（fluorophores）的不同之处在于：㈠配体（不是镧系离子本身）从外部吸收能量发生S0到S1转化，然后在发生内部转化。㈡从最低级的振动水平S1跃迁到三重态（T1）水平的内系统交叉，进一步促进能量在分子内部的转移，从配体的T1状态下转移到螯合物镧系离子外层4f的电子轨道，即能量从螯合物转移到了镧系离子，使镧系离子处于激发态。这个过程需要使配体（一般为螯合物）内转化减小或失活（S1 S0和T1 S0），同时要求处于T1状态下的配体能量水平与镧系离子共振水平相匹配（靠近或稍高）。㈢多重发射。在镧系复合物中，由于少数几个电子转移5D0 7FJ（J=0，1，2，3，4）和5D0 7FJ（J=1，2，3，5，6），其中最集中的转移是5D0 7F2和5D0 7F1， 出现了多重发射现象，伴随发射波长610—660nm和585—600nm。

在上述发射荧光机理中镧系复合物有三个主要优势：

（1）最大的Stokes位移，荧光物质激发光谱曲线的最大吸收波长和发射光谱的最大发射波长之间的差,称为Stokes位移。在内部转移期间，由于能量的分配，内系统的交叉，分子内部的能量转移，使从镧系复合物发出的量子与激发光有明显的不同，Stokes位移达200nm,很容易分辨激发光和发射光，从而排除激发光干扰。而普通荧光物质荧光光谱的Stokes位移只有几十纳米，激发光谱和发射光谱通常有部分重叠，互相干扰严重。镧系复合物的这种特性可避免激发光谱和荧光发射光谱以及生物基质发射的光谱重合（见图1.2）。

图1.2 Unique fluorescence properties of lanthanides, large Stokes’ shift

（2）镧系元素与普通的荧光团比较，镧系元素离子螯合物荧光的衰变时间（decay time）长（10～2000us），为传统荧光的103～106倍（见图1.3）。镧系元素的荧光不仅强度高，而且半衰期也很长，介于10～1000us之间。这样，用时间分辨荧光仪测量Eu3+螯合物的荧光时，在脉冲光源激发之后，可以适当的延迟一段时间，待血清、容器、样品管和其他成分的短半衰期荧光衰变后再测量，这时就只存Eu3+标记物的特异性荧光，即通过时间分辨，极大地降低了本底荧光,实现了高信噪比,这是TRFIA高灵敏度和低干扰的原因之一。如果在使用链霉亲合素-生物素系统,可更好地降低非特异性荧光的干扰；

图1.3 Unique fluorescence properties of lanthanides, long fluorescence decay times

(3) 镧系螯合物激发光光谱较宽，最大激发波长在300～500nm，可通过增加激发光能量来提高灵敏度。而它的发射光谱带（line-like bands）很窄，甚至不到10nm，可采用只允许发射荧光通过的滤光片，进一步降低本底荧光，镧系复合物虽然量子产量较常规的荧光团为低的主要波段的荧光强度是非常强的，原因在于能量的转移大部分是通过这个波段发射的。狭窄的发射波段为多次分析成为可能，更不必担心光谱重叠（见图1.4）

图1.4 The wavelength of the fluorescence light，narrow emission band