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IP,Co

2023-03-29 19:38| 来源: 网络整理| 查看: 265

理论知识点看了千千万,但是还是容易混淆概念傻傻分不清IP,Co-IP,GST-Pull Down,本期我们不止放送有IP与Co-IP区别知识要点,而且也将研究蛋白互作几种方法(酵母双杂交系统(Y2H),CO-IP的关系,GST-Pull Down)之间的区别以及优缺点简明扼要的收纳进来,让您快速区分IP,Co-IP,GST-Pull Down:

独角戏——IP:

免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)就是用偶联相应抗体的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下来,然后去检测它。例如蛋白X在细胞内的蛋白量不同,或者有着不同的翻译后修饰,这时就可以用X蛋白抗体+Prorein A beads来进行IP,从细胞中把蛋白X拉下,再用特异的抗体(如磷酸化,泛素化抗体)进行WB来检测蛋白X的变化。简言之,IP就是检测单个蛋白的状态(高矮胖瘦,有没有戴帽子,穿的什么衣服等等)。

免疫沉淀(IP)

众里寻她千百度——酵母双杂交系统(Y2H):

酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物转录调控过程的认识。真核生物中基因转录需要转录激活因子的参与,真核生物的转录激活因子含有两个不同的结构域:DNA 结合结构域(DNA binding domain,DNA-BD)和DNA转录激活结构域(Activation domain,AD),这两个结构域可以独立分开,功能互不影响。BD和AD分别单独作用并不能激活转录反应,只有当二者在空间上充分接近时,才呈现完整的转录激活因子活性,使下游基因得到转录。根据这一原理,可设计酵母双杂交系统。

将两待研究蛋白(蛋白 X 与蛋白 Y)分别与 BD、AD 结构域构建融合质粒。将构建好的两个质粒转入同一酵母细胞中表达,如果两蛋白之间不存在相互作用,则下游基因(报告基因)不会转录表达;如果两个蛋白间存在相互作用,则BD与AD两结构域空间上很接近,从而下游基因(报告基因)得以转录。通过报告基因表达与否,即可判断两蛋白之间是否存在相互作用。

通常在现实情况中,与蛋白X存在潜在互作可能的候选蛋白会有好几种(Y,Z,A,B等),这时我们就可以通过酵母双杂交在体内筛选与X有相互作用的蛋白Y

遇见爱情——Co-IP:

竟然我们在体内验证过,那么蛋白X和蛋白Y在体外是否也存在相互作用了?这个时候我们可以用到Co-IP了~

免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)的原理和IP是一样的,当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质相互作用被保留了下来,假如细胞内存在 XY 蛋白复合物,用 X(X也称为诱饵蛋白)的抗体免疫沉淀 X,那么与X 在体内结合的蛋白质 Y(Y也称为靶蛋白)也被沉淀下来。因此在细胞裂解液中加入 X 的抗体沉淀蛋白X,随后利用蛋白印迹(western blot,WB)检测沉淀中是否存在蛋白 Y,如果存在,则说明细胞内存在XY蛋白复合物,即蛋白XY存在相互作用。(在体外验证X和Y之间有联系)

免疫共沉淀(Co-IP)

在我们用酵母双杂交和Co-IP双保险验证X和Y之间确实存在相互作用后,我们发现酵母双杂交和Co-IP的结果都只能说明X和Y之间有相互作用,但并不能确定这种相互作用是直接的还是间接的,这个时候存在两种可能:

X与Y之间存在直接的相互作用(X和Y自由恋爱一见钟情)也就是说也许是X与M相互作用,而Y也和M相互作用,这样,用A的抗体可以把M拉下来,但同时M又把B也拉下来了(X和Y是通过他们共同的朋友M介绍才认识然后在一起的)

要想准确确定X和Y直接的作用到底是直接的还是间接的了,这个时候我们需要祭出我们大boss——GST-Pull Down实验~

GST-Pull Down:

GST-Pull down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术, 近年来越来越受到广大学者的青睐。

原理:将靶蛋白和GST组成的融合蛋白固定在谷胱甘肽(GSH)亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得,此方法简单易行,操作方便。

Co-IP和酵母双杂的比较

免疫共沉淀(Co-IP)GST-Pull down酵母双杂交(Y2H)原理抗原抗体反应的特异性GST对谷胱甘肽偶联球珠的特异性真核生物转录调控过程检测瞬时相互作用否否是检测弱相互作用否否是检测直接相互作用否是否验证方式体外直接或间接相互作用检测体外直接的相互作用检测体内直接或间接相互作用检测是否需要蛋白纯化是是否是否需要抗体是否否

如何选择:

Co-IP,GST-Pull down和酵母双杂交是研究蛋白互做最常用的三种方法,一般常用酵母双杂交来筛选,用Co-IP和GST pull down用来验证。研究不仅在整体蛋白层面,还包括蛋白的结构域层面,GST pull down是用来验证蛋白X与Y是直接结合的,而Y2H和Co-IP结果则还有间接作用以及非特异性作用。

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