膜体系文库构建

常见问题  

1.构建核体系文库还是膜体系文库，如何选择？

需要老师对目标诱饵基因有详细的了解：

如果诱饵定位在细胞核则选择核体系文库；

如果诱饵定位在细胞膜则选择膜体系文库；

如果诱饵定位不确定，可以选择Gateway体系，使用一份样本同时构建核膜文库，分别筛选。

特别提醒：选择膜体系筛库需先进行功能验证实验，功能验证通过后才可以进行文库筛选，如果功能验证未通过，可以尝

试去掉跨膜域更换为核体系，但存在蛋白空间结构发生变化的风险。

2.如何选择膜体系诱饵载体？

3. 如何检测文库的库容、插入片段平均长度、重组率？

文库滴度（每毫升文库菌液库容量）的计算公式：

CFU/ml = 平板上的克隆数/平板上涂布菌液的体积 μl×n×1000μl其中 n 是原始菌液的稀释倍数；总的文库库容（CFU）= CFU/ml ×文库菌液的总体积（ml）

插入片段平均长度：随机挑取 24 个菌落 PCR 所得到的插入片段长度的总和的平均值

重组率：根据菌落 PCR 中所有阳性插入片段的克隆在总检测克隆数中所占比例

4.酵母菌落为什么变红色？ 

形态正常，只是菌落颜色变红不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的 Adenine 

被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成 Adenine以供利用。然而有些菌株的ADE2基因被破坏，Adenine合

成途径受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中间产物 P-ribosylamino imidazole (AIR) 在细胞中积累而

使菌落变为粉红色。

5.送样要求是什么？

total RNA：SMART法：≥1 µg；Gateway法：≥200 µg（OD 260/280 值应在 1.8 - 2.2 之间；Agilent 2100 score ≥ 7）

植物样本：>5 g

动物样本：>1 g

细胞样本：>5*107 cfu

RNA 得率低或难抽提样本需酌情增多送样量