中国农业大学生物学院 综合新闻 Food Chemistry

2021年1月19日，中国农业大学生物学院姜伟老师课题组在Food Chemistry杂志上在线发表了题为“High efficient degradation of glucan/glucomannan to cello-/mannan-oligosaccharide by endoglucanase via tetrasaccharide as intermediate”的研究文章。

由β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶生产的甘露低聚糖(MOSs)或木低聚糖(XOSs)在各种工业部门，如食品和饲料工业中都很重要。然而，对内切葡聚糖酶产生的多糖的研究仍是目前研究的热点。

该研究利用毕赤酵母表达系统对来源于出芽短梗霉菌的β-葡聚糖酶(称为ApCel5A)进行高效的异源表达，并检测出该酶具有内切葡聚糖酶(1270U/mg)和甘露聚糖酶(31.2U/mg)两种不同的酶活性。通过信号肽工程改造和大规模高密度的发酵，使得内切葡聚糖酶的酶活性提高到了6.63倍。其与商业纤维素酶1.5L具有高效的协同效果，并对低pH（2.5）、胆酸盐和蛋白酶具有良好的耐受性，在生物资源、食品和饲料行业具有潜在的应用前景。后续的定点突变实验表明，ApCel5A中残基Glu245和Glu358是关键的催化位点，而Asp118、Asp122、Asp198和Asp314是辅助催化位点。更重要的是，ApCel5A以含有葡萄糖残基还原端的四糖作为中间体，对葡聚糖和葡甘露聚糖底物具有较高的降解效率。本研究阐明了优化内切葡聚糖酶表达的有效方法和多种底物降解的详细催化机制，为内切葡聚糖酶的应用提供了新的思路。

通过对八种不同信号肽的重组菌株内切葡聚糖酶的酶活进行比较，最高胞外酶活为 Ser-Cel5A 重组菌株 (使用血清白蛋白信号肽)，达到了 261.45 U/mL是初始菌株 (使用α因子作为信号肽)的 1.7 倍 (153.18 U/mL)。表明在 8 种信号肽中，血清白蛋白信号肽最适合 ApCel5A 的胞外分泌，用筛选出来的 Ser-Cel5A 重组菌株进行进一步的表达优化。为了进一步提高表达量，将重组菌株 Ser-Cel5A 在 7.5 L 的自动发酵罐中进行高密度发酵培养，通过大规模培养其胞外酶活达到1025.32 U/mL。

以CMC、KGM、纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖和纤维五糖为底物，研究了ApCel5A的水解作用模式。HPLC分析显示，CMC被降解为葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖的混合物。而KGM被水解成葡萄糖、甘露二糖和甘露三糖。低聚糖的降解表明，ApCel5A对聚合程度(DP)>3的纤维多糖具有活性，因为纤维四糖(G4)和纤维五糖(G5)通过ApCel5A的水解作用降解为葡萄糖、纤维二糖(G2)和纤维三糖(G3)。

利用在线的 SWISS-MODEL 模拟 ApCel5A 的三维结构及可能的催化活性位点，利用融合 PCR 的方法构建了关键氨基酸的突变菌株，并通过水解实验检测 ApCel5A 各个突变株对于多种底物的水解能力。结果表明 ApCel5A 能够高效的将葡甘露聚糖 KGM 和 CMC 降解成甘露寡糖和纤维寡糖，对两种降解机制进行整合，总结出了一个通用的内切酶作用机制，首先是在底物还原端的葡萄糖残基被识别之后，在 Glu245、Glu358、Asp118 和 Asp314 的共同作用下生成还原端为葡萄糖残基的四糖和其他产物，还原端为葡萄糖残基的四糖能够继续进行降解生成单糖，二糖和三糖，从而组成种类多样的产物。这种降解机制适合含有葡萄糖残基的聚合物，为内切酶的应用方向提供了理论依据。

本研究通过多种策略高效表达了 ApCel5A 内切酶，并通过关键氨基酸突变菌株的构建揭示了 ApCel5A 内切酶降解不同底物的机制，总结了 ApCel5A 的通用降解机制，在工业上为内切酶的应用提供了一定的理论支持。

该文章中中国农业大学生物学院姜伟副教授为论文通讯作者，博士研究生苗挺为本文的第一作者。中国农业大学生物学院博士生Abdul Basit、温佳琦、刘军权、郑锋振为共同作者。该研究得到了中国国家自然科学基金项目（31570067）和农业生物技术国家重点实验室开放学科(2020SKLAB6-12)的资助。感谢中国农业大学动物科技学院曹云鹤老师对实验给予的帮助。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2021.129175