【实验3 酵母核糖核酸的提取及测定实验报告 3900字】范文118

生物化学实验实验报告

实验三酵母核糖核酸的提取及测定

生物103班 1002040310 赵宁宁

搭档 1002040301 井 恬

一． 研究背景及目的

核酸是生命的最基本物质之一，广泛岑在于所有动植物细胞、微生物体内。对核酸

的研究是更深入研究生命体的基本前提之一。研究核酸需要纯度很高的核酸，所以核酸的提取方法也就在生物学研究中相当重要。本次实验提取酵母的核糖核酸（RNA）。RNA离体后稳定性很差，含量低，所以在提取的时候就要注意防止核酸的降解和变性，防止过酸、过碱、避免剧烈搅拌，尤其重要的是防止RNA酶的作用。本实验是医药卫生领域与大工业生产的基础方法。

通过前两次实验我们学会了测定蛋白质含量以及酶的活性，掌握了研究这两种生物大分子的基本方法，本次试验我们将学会如何分离纯化RNA，以及分离纯化的基本原则和操作细节，进而初步了解生物制品开发的基本思路。

二． 原理

核酸（RNA）都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖、碱基和磷酸以等分子比例构成的，故测定组成核苷酸的任意一种组分即可以测定生物体内核酸的含量或者是提取出来的核酸的含量。

提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。使用浓盐法提取RNA的时候应该注意掌握温度，直接至90~100℃浸提，避免在20~70℃的时间过长，因为这是磷酸二酯酶和磷酸单酯酶的作用活跃的温度范围，会使RNA降解而降低提取率。这两种方法是从废弃的啤酒酵母中提取RNA的一般方法。但是这两种方法各有利弊，如浓盐法提取的RNA纯度高，而稀碱法提取的时间短，提取率高，更利于工业化生产[2]。本实验采取浓盐法。

目前测定核酸含量的方法主要有以下四种：定磷法（RNA/DNA）、戊糖测定法(RNA)、脱氧戊糖测定法（DNA）和紫外吸收法（DNA/RNA）。定磷比色法是有准确，微量，快速的特点，是测定核酸含量的最好方法，戊糖测定法和脱氧戊糖测定法是通过糖的颜色反应来测定RNA和DNA的，方法简单，快速，但是当样品中含有粘多糖和蛋白质存在的时候对测定会有干扰。紫外吸收法简单，快速，微量，但是容易受到蛋白质以及含有工而双肩的物质干扰。本实验采用的是紫外吸收法来测定RNA的含量。核酸所含嘌呤和嘧啶分子具有共轭双键，在260nm波长处有最大吸收峰，故通过测定提取到的RNA的OD260值便可以得到核酸的含量，进而计算产率。

三． 仪器与试剂

1.仪器

UV-9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；

TDL-40B离心机（上海安亭科学仪器厂）；

DL-101-3BS 电热鼓风干燥箱（天津市中环科技开发公司）；

电磁炉，移液枪（大龙）；

中字牌架盘药物天平（北京天平物华医疗仪器有限责任公司）；

HC.TP12B.1型架盘药物天平（北京 武天平厂）；

FA 1004 电子分析天平（上海精密仪器科技厂）；

2.主要器皿

研钵；

15ml 具塞刻度试管、三角瓶、烧杯、玻璃棒；

容量瓶。

3. 材料

干酵母粉。

4.试剂

10% NaCl，6M HCl，95%乙醇（分析纯），2%氨水，RNA沉淀剂。

四． 实验方法/操作步骤

1.酵母核糖核酸的提取

2. 核糖核酸含量的测定（紫外分光光度法）

（1）制备匀浆：玻璃匀浆器内加入5ml蒸馏水→匀浆至均一的胶体溶液→转入小烧杯（10ml左右蒸馏水分次清洗并入）→混匀，2%氨水调节pH至7.0→转入25ml容量瓶，定容，混匀。

五． 数据整理

六． 结果计算与讨论及分析

1.结果计算

制品纯度（%）=

1

×5000××10-6×100%=74.40% 0.02270.419

制品纯度×总制品重

产率：RNA提取率（%）=100%=1.52%

7

2.讨论及分析

通过本次我们学会了如何提取RNA以及测定其含量。从得到的数据来看，提取的样品纯度还不是太高，但查阅资料得知浓盐法提取得到的RNA纯度应该比稀碱法要高，由此可知，在实际的生产中，最常用的此两种方法的到的RNA产品的纯度都不是很高。本实验的提取率在实验过程中损失了不少，例如在用硫酸纸转移的时候因为硫酸纸的弹性而使得一小部分产物掉落。本实验中有很多操作细节需要相当严谨的完成，比如水浴时间，离心时间，沉淀取上清液等，只有小心翼翼充分细心的做好这些细节工作，产率会有一定的提高。

七. 结论与展望

本次试验采用的是浓盐法来提取RNA。通过分析数据结果得知提取的RNA纯度不是很高。我在想如果市场上需要纯度很高的RNA去做研究的时候怎么办呢？当然，还有其他提取RNA的方法，如TROzlo法、CTAB法等。随着核酸在食品、医药、农业等领域的不断进一步的应用，更加廉价，简便的方法也会相应的被发明出来，以便在规模化生产上可以产生

更多的效益[3]。现在利用稀碱法与浓盐法主要是对啤酒废酵母的再利用。这也反映了一个问题，就是在实际的生产中，要能做到尽量的利用副产物来生产更多的价值。本次试验中，提取了RNA以后，酵母细胞的其他成分就废弃掉了。但是如果能在实际生产中回收废弃物，作为肥料等物质再利用，就更好了。

八. 思考题及质疑

1、本实验为何选用酵母为生产原料？在分离纯化的实验选材上有哪些主要原

则？

答：因为酵母细胞中核酸的含量非常高，且主要是RNA，其含量可达2.67%~10.0%。而DNA的含量较少，在测定RNA的含量时DNA对测定的影响非常小，故选取酵母为生产原料。

在分离纯化的实验选材上应该注意以下几点：待分离物质再材料中的含量要高；提

取方法要简便；杂质要少，保证提取后提取物的纯度。如果是用于规模化生产的话，必不可少的一个就是要考虑材料的价格。

2、浓盐法的选择是基于怎样的考虑？

答：目前比较常见的几种提取ＲＮＡ的方法是稀碱法和浓盐法。前者是利用碱使细菌细胞壁溶解，是RNA释放出来，后者是在加热的条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来。RNA 的磷酸酯键易被稀碱水解，生成3＇-核苷酸和2＇-核苷酸的混合物。工业上多采取稀碱法提取 RAN 是为了获得核糖核苷酸，RNA 被水解与否并不重要。这次试验中需要得到具有活性的RNA分子，RNＡ的一级结构稳定才能维持 其活性，因此不选用稀碱法提取RNA。

3、本方法为何选用等电点沉淀作为最主要的纯化步骤？

答：纯化RNA 可选择“异硫氰酸胍-苯酚-氯仿”抽提，可除去蛋白质和RNase，也可选择根据RNA 在等电点的pH 环境下溶解度最小来纯化RNA。由于有机溶剂有毒且易燃，存在安全隐患，不适宜应用到大规模工业生产，且相对于等电点沉淀来说污染较大。

4、DNA 的去除本方法是怎样考虑的？

答：DNA的活性体现在其一级结构的稳定上。DNA在高温下双链会因氢键的断裂而形成两条链，吸光度升高，粘度下降，活性丧失。但是如果环境温度慢慢降低的话被解开的两条单链ＤＮＡ会慢慢配对，DNA就会复性。所以在试验中采取高温水浴，使DNA完全解旋以后使其骤冷，让DNA完全失活。利用溶解度的差异可以分离DNA和RNA。

5、大量的乙醇洗涤在工业生产上有否危险隐患？厂家是如何考虑的？

答废旧的乙醇可以净化以后回收再利用。乙醇是易挥发物质和燃品，有很大的安全隐患。乙醇洗涤有很多的好处，可以脱去色素，脂溶性杂质，还可以使RNA分子脱水，易于烘干。由于RNA 分子在乙醇溶液中水化层被破坏，磷酸基团暴露出来，并与Na 结合，最终使RNA 沉淀，增加产率。因此乙醇洗涤时必须的。

6、本实验在用紫外法测定 RNA 含量时，为什么要固定测定液的 pH 值，若 pH 值不固 定，会影响测定结果吗？为什么？

答：用紫外法测定 RNA含量的原理是，嘌呤和嘧啶环具有共轭双键，使核酸在260nm 处

有最大吸收峰值。如果溶液的pH 不固定，碱基的构象会不稳定，使紫外吸收值也不同， 测得的浓度不准确。

7、在测定中，加钼酸铵-过氯酸沉淀剂的作用是什么？离心除去沉淀后，其上清液为什么要稀释100 倍？

答：加沉淀剂是为了使RNA沉淀，以获得含有除去RNA之外其他所有试剂的待测液，作

为空白对照管标定100%T。测定RNA 含量时采用比消光系数法，实验的依据为朗伯比尔定律A= εbc，其中ε和b 都已确定，而且A的数值在0.2-0.8 之间误差最小，结果最为可靠，因此需要稀释溶液使A在该范围之内。

实验小结

1.离心机在实验室中属于危险仪器，在使用的过程中应当相当小心。本次实验时有一次离心刚开始时忽然觉得离心机盖没有锁紧，于是我试图轻轻地抬起离心机盖以确认是否盖紧。但此方法是错误的，有相当大的安全隐患。正确的处理方法是，只要觉得离心机运作有问题，便关掉电源，待离心机停止转动之后再打开机盖，重新按流程操作，确保无误再次开机。

2.本实验中使用硫酸纸来盛放提取出的RNA。待RNA干燥为粉末的时候，由于硫酸纸的弹性比较大，很容易将RNA弹出一部分。是否可以考虑换一种盛放RNA的物品，来解决这一问题。

十.参考文献

[1]生物化学实验指导.中国农业大学自编教材.

[2] 孙荣丹，刘莹，张洪林，王占勇，秋峰.浓盐法与稀碱法在啤酒废酵母中提取RNA的研究[J].氨基酸和生物资源.2006.28(3)：76~78

[3]王定昌，徐达伍.核酸酵母产品的开发和应用[J].粮油食品科技.2012.4.10

第二篇：酵母核糖核酸的提取及测定 4100字

酵母核糖核酸的提取及测定

植物098 原硕 0901080808

摘要：用浓盐法提取酵母RNA，经过多步分离提纯，在现有实验条件下，

得到样本RNA含量=67.5%，RNA提取率=1.2%

关键字：酵母，浓盐法，RNA含量，提取及测定

一、 研究背景及目的：

RNA作为细胞中参与基因表达和蛋白质合成的重要物质，在平时学习中多有涉及，本实验通过从酵母中提取RNA，掌握提制RNA的方法并掌握其测定手段，巩固离心机和紫外分光光度计的使用。

二、 研究依据及原理：

酵母作为工业上大量生产核酸的最为理想的微生物，因为酵母核酸中主要是RNA（2.67~10.0%），DNA很少（0.03~0.516%），菌体容易收集，RNA也易于分离。此外，抽提后的菌体蛋白质，也具有很高的利用价值。

RNA提取过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去，再根据核酸在等电点溶解度最小的性质，将pH调到2.0~2.5使RNA沉淀，进行离心收集。

提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱性和浓盐法。 本实验采取浓盐法（10%NaCl）

核酸不论是DNA还是RNA，都是由核苷酸组成的多聚核苷酸化合物，而核苷酸是由糖，碱基和磷酸构成。

要测定生物体内核酸的含量或者测定提取出来的核酸含量，只

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需要测定组成核苷酸的一种成分，如磷，糖或碱基，便可计算出核糖的含量，因为核算分子中这三个组份是以等分子比例存在的，即每一个嘌呤或嘧啶分子都与一分子戊糖及一分子磷酸相连接的，所以只要测出其中任何一组分的含量即可求出核糖的含量。

本实验采用紫外吸收法测定核糖核酸含量，因为核酸的组成成分嘌呤及嘧啶碱基具有强烈的紫外吸收，最大吸收在260mm处，利用此特性可以对核酸进行定量测定。

三、 实验材料与方法：

1、 材料：干酵母（安琪牌）

灰蓝色pH试纸和黄色pH试纸

2、 试剂：

（1）10%NaCl

（2）6NHCl

（3）95%乙醇（分析纯）

（4）5~6%的氨水

（5）RNA沉淀剂

取0.5克钼酸铵，加水193ml，加7ml 70%过氯酸，总体积200ml。（70%过氯酸即高氯酸，原液浓度即是70%）。

3、 仪器：

（1） 量筒：50ml；具塞试管：15ml×2

（2） 三角瓶：100ml；容量瓶：25ml×1,50ml×2

（3） 烧杯：50ml×3

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（4） 表面皿：6cm×1

（5） 滴管，玻棒，移液器，塑料碗

（6） 烘箱

（7） 离心机

（8） 托盘天平，分析天平

（9） 匀浆器

（10） 紫外分光光度计（Rayleigh，UV-9600）

4、 实验方法：

1） 提取：称取7g酵母，研钵中研磨成粉末，倒入三角瓶中，

然后量取50ml 10%NaCl溶液，倒入三角瓶，是酵母粉充分彻底悬浮，之后小心放入沸水浴中，浸提半小时。

2） 分离：将上述提取液取出，于冰浴中彻底冷却，转入离心

管，以3500r/min离心30min。使提取液及菌体残渣等分离。

3） 沉淀RNA：将离心得到的上清液，小心倾倒于50ml小烧

杯中，并置于冰浴中冷却，待溶液冷却至10℃以下后，于冰浴中在搅拌下（注意不要过分剧烈）小心用6MHCl调节pH至2.0~2.5（用灰蓝色pH试纸），调好后继续于冰水中放置10min。

4） 洗涤纯化：将上述悬浊液小心转入离心管，以3000r/min

离心10min，得到RNA沉淀。小心倾去上清液，直接与离心管中用95%乙醇洗涤RNA沉淀两次，每次用15ml

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乙醇，充分搅拌洗涤，然后以3500r/min离心6min。

5） 干燥：用牛角勺仔细将洗涤后的RNA沉淀从离心管内挖

出涂于事先将边缘折起成框的称量纸上（预先用分析天平称重并记录数据），涂布均匀后，小心置于80℃烘箱内5min左右，使沉淀充分干燥。将干燥后的RNA制品连同称量纸一起准确称重，而后小心将RNA制品的大部分转移至匀浆器中，将称量纸和残余RNA制品再次称重，记录下所有数据。

6） 含量测定（紫外分光光度法）：采用比消光系数法，比消

光系数本实验中给定A260=0.022。

测定步骤：

将第5步中得到的溶液,转入小烧杯中，用5%氨水小心调pH至7.0（用黄色pH试纸），最后转入25ml容量瓶，用蒸馏水定容。

取两支试管，按下表操作：

摇匀，冰浴20min，转入离心管3500r/min离心10min，小心取上清液，各取0.5ml至50ml容量瓶，蒸馏水定容，其中一个做标准空白液，在紫外分光光度计上测定OD260值。

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四、 实验结果及计算：

1） 原始数据：

称取酵母量（样品重）W=7g

空白称量纸重 W1=0.6048g

总制品+纸重 W2=0.7282g

残余制品+纸重 W3=0.6198g

比消光系数 A260=0.022

测定消光值 OD260=0.322

透光度T=47.6%

2） 推演数据：

总制品重：G1=0.1234g

定量样品重：G2=0.1084g

3） 结果计算：

（1） RNA含量（%）=

V：被测样品体积 E260A260×V×D×1G2×100%=67.5%

D：样品测定时的稀释倍数

（2） RNA提取率（%）=RNA含量×G1W×100%=1.2%

五、 结果分析：

本实验使用浓盐法和紫外分光光度法提取和测定了酵母的核糖核酸含量。

实验中，有如下几处可能产生误差，1、研磨时的充分程度，研磨的充分程度的不同，将直接影响最后所能提取到的RNA含量的多

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少。2、本实验过程中，多次涉及到样品转移、离心、洗涤过程中，将不可避免的造成样品的损失，直接造成最终RNA提取率的下降。3、实验操作过程中，实验人员并未佩戴手套，人体附带的RNase一类的酶可能会造成一定量的RNA分解。4、烘干后的RNA样品很轻，在称量、转移过程中很容易造成损失。

综上所述，本实验中一定未能提取出酵母的全部RNA，实验过程中必然造成了样品一定程度上的损失，参考酵母RNA含量（2.67~10.0%），以及在A260/A280=1.983时，90g湿酵母（相当于20g干酵母）可提取1gRNA（选自：李志东 邱峰 张洪林，《影响浓盐法提取啤酒酵母RNA的工艺参数研究》，《化工技术与开发》20xx年第36卷第2期，12页36卷），考虑到本实验的实验条件及上面提到的误差因素，本实验结果在RNA含量和RNA提取率上都基本让人满意。

六、 参考文献：

1、 李良秋 黄晓兰，《高效液相色谱法测定酵母RNA中四种生物碱基的含

量》，第二届全国发酵工程学术讨论会第二届全国发酵工程学术讨论会论文集，19xx年

2、 徐希柱，《啤酒酵母中RNA、β-（1，3）-D-葡聚糖和蛋白质的提取及

应用研究》，《山东农业大学》 20xx年

3、 田宝勇 赵星洁，《啤酒酵母RNA降解产物5′-核苷酸的高效液相色谱

分析》，《酿酒科技》,20xx年第3期

4、 李珊 吴振强，《盐法提取啤酒废酵母RNA的研究》，《酿酒科技》2005

年第7期

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5、 朱俊东 黄国荣 糜漫天 郎海滨，《啤酒酵母中提取核糖核酸的研究》，

《食品科学》160 2006, Vol. 27, No. 02

6、 廖鲜艳 李永仙 等，《啤酒酵母胞内RNA提取的研究》，《酿酒》2002

年第29卷第2期

7、 李志东 邱峰 张洪林，《影响浓盐法提取啤酒酵母RNA的工艺参数研

究》，《化工技术与开发》20xx年第36卷第2期

8、 曹成喜 等，《生物化学仪器分析基础》，2008，化学工业出版社

9、 孙培龙 吴石金，《生物化学技术实验指导》，2008，化学工业出版社

10、 张龙翔 张庭芳 李玲媛，《生化试验方法和技术》，1997，高等教育出版

社

七、 思考题：

1、 RNA中的嘌呤碱基和嘧啶碱基在不同pH条件下异构情况

不同，对紫外光的吸收值不同，摩尔消光系数会随之改变。所以应固定pH值；pH不固定会影响测定结果。因为pH不同的条件下，OD值也会随之改变，而实验中所给的比消光系数是在一定pH值下给定的。所以pH值不固定会影响测定结果。

2、 1）加钼酸铵―过氯酸沉淀剂是为了沉淀RNA，然后用得到

的上清液做空白对照，以减少定量样品重的蛋白质、糖类等物质对RNA含量测定的干扰；2）由朗博―比尔定律A=εbc，当吸光度在0.2~0.8时，测量误差最小，本实验中ε、b都已固定，只能改变浓度c，是A在上述范围内，所以要稀释。

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3、 1）总体策略：保持物质活性，结构完整，纯化到所需浓度，

能够大量提纯（量产）；2）分离纯化生命大分子时要注意：保持所提取物质活性；抑制或避免接触所能分解被提纯物质的酶，以免物质被酶分解；反应条件应温和，避免能破坏生命大分子的因素。

八、 实验小结：

酵母作为工业上大量生产核酸的最为理想的微生物，因为酵母核酸中主要是RNA，DNA很少，菌体容易收集，RNA也易于分离。因而本实验使用浓盐法和紫外分光光度法提取和测定了酵母的核糖核酸含量。

实验过程中，通过浓盐法提取出样品酵母中的RNA，经过多次分离提纯，最后用紫外分光光度发，通过吸光率，测定了样品中的RNA含量。计算出RNA提取率。

实验中从在几处误差，使得实验数据在现有条件下不可避免偏低，但参考酵母RNA标准范围（2.67~10.0%），以及在A260/A280=1.983时，90g湿酵母（相当于20g干酵母）可提取1gRNA（选自：李志东 邱峰 张洪林，《影响浓盐法提取啤酒酵母RNA的工艺参数研究》，《化工技术与开发》20xx年第36卷第2期，12页36卷），实验结果基本让人满意。

通过实验，我们更充分的理解了浓盐法提取RNA的原理，加深了对RNA相关性质的理解，对其含量有了一定的感性认识。

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