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(一)原理 细胞内大部分RNA 均与蛋白质结合在一起,以核蛋白的形式存在。因此,提取RNA时要把RNA与蛋白质分离并除去。将细胞置于含有十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)的缓冲液中,加等体积水饱和酚,通过剧裂振荡,然后离心形成上层水相和下层酚相。核酸溶于水相,被苯酚变性的蛋白质或者溶于酚相,或者在两相界面处形成凝胶层。 本实验采用的0.15mol/L 缓冲液系统可使大部分RNA-蛋白复合物解离,而DNA-蛋白复合物只有极少部分解离;用酚处理时DNA-蛋白复合物变性,在低温条件下从水相中除去,这样得到的RNA 制品中混杂的DNA 极少。用氯仿-异戊醇继续处理RNA 制品,可进一步除去其中少量的蛋白质。最后用乙醇使RNA 从水溶液中沉淀出来。本法得到的RNA 不仅纯度高,而且多呈自然状态,可供继续研究之用。 (二)主要仪器和试剂 1、仪器(1)台式高速离心机(10 000r/min) (2)水浴 (3)Eppendorf 管(1.5mL) (4)紫外可见分光光度计 (5)冰箱或冷柜(0~4℃) (6)振荡器 (7)分析天平(精确至0.1mg) (8)真空干燥器 2、试剂(均为分析纯)(1)SDS-缓冲液:0.3% SDS,0.1mol/L NaCl,0.05mol/L 乙酸钠,用乙酸调到pH5.0。 (2)饱和酚液:重蒸苯酚用(1)溶液饱和。 (3)氯仿-异戊醇液:24﹕1(V/V)。 (4)含2%乙酸钾的95%乙醇溶液。 (5)无水乙醇 (6)乙醚 (7)溶菌酶(B.R.)(1mg/mL) (三)操作步骤 1、取1g 活性干酵母在研钵中研碎,加10mL SDS-缓冲液使成匀浆,洗入各Eppendorf管(略少于管容积的一半),加溶菌酶0.1mL,混匀,室温静置10min,再加等体积饱和酚液,室温下剧烈振荡5min。 2、置冰浴中分层,在0~4℃低温环境下,10 000r/min 离心10min.吸出上层清液,转入新的Eppendorf 管,加等体积氯仿-异戊醇,室温下剧烈振荡2.5min,然后10 000r/min 离心5min。 3、吸出上层清液,转入另一新Eppendorf 管,加2 倍体积95%乙醇(含2%乙酸钾),在冰浴中放置30min,使RNA 沉淀。 4、再以10 000r/min 离心5min,弃上清液,沉淀用少许无水乙醇和乙醚各洗一次,即加乙醇或乙醚,迅速离心各1min,保留沉淀。 5、倾去乙醚后,减压真空干燥,准确称重,记录。 6、RNA 制品纯度的测定及RNA 提取率的计算与浓盐法相同。 |
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