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在过去的十年中，冷冻电子显微镜（cryo-EM）已被确定为蛋白质结构测定的常规方法，在已发表的结构数据中所占的份额越来越大。TEM技术和自动化的最新进展提高了数据收集速度和采集图像的质量，同时降低了在低于3 Å分辨率下获得冷冻电镜图谱所需的专业知识水平。虽然大多数这种高分辨率结构都是使用最先进的300 kV冷冻透射电镜系统获得的，但使用200 kV冷冻透射电镜系统也可以获得高分辨率结构，特别是当配备能量滤波器时。此外，通过实时图像质量评估实现显微镜对准和数据收集的自动化降低了系统复杂性，并确保了最佳的显微镜设置，从而提高了高质量图像的产量和数据收集的整体吞吐量。该协议演示了在200 kV低温透射电子显微镜上实现的最新技术进步和自动化功能，并展示了如何收集数据以重建足以从 头 原子模型构建的3D图。我们专注于最佳实践，关键变量和常见问题，必须考虑这些问题才能实现此类高分辨率冷冻电镜数据集的常规收集。特别是详细回顾了以下基本主题：i）显微镜对准的自动化，ii）选择适合数据采集的区域，iii）用于高质量，高通量数据收集的最佳光学参数，iv）用于零损耗成像的能量滤波器调整，以及v）数据管理和质量评估。最佳实践的应用和使用能量滤波器实现的分辨率的改进将在apo-铁蛋白的例子中展示，该apo-铁蛋白酶被重建为1.6Å，而 热质嗜酸酶 体20S蛋白酶体使用配备能量滤波器和直接电子检测器的200 kV TEM重建为2.1-Å分辨率。
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