蛋白系列课程

3.分开两块玻璃板，根据目的蛋白的分子量大小，按着marker来切取自己需要的部分，将切除的部分浸入转膜液中平衡10分钟（若目的蛋白分子量较小，可不用等10分钟，因为小分子蛋白容易扩散出胶）。

4．PVDF膜激活：将合适大小的PVDF膜浸入装有甲醇的小盒子中，使其激活（变为相对透明的颜色即为激活成功）。

5．制作“三明治”：从下到上为海绵+滤纸+胶+PVDF膜+滤纸+海绵，每层放好，去除各层间的气泡。

将PVDF膜置于胶上，要完全覆盖。

制作完三明治，用转膜夹夹住。

将夹好的三明治放入转膜装置中，倒入转膜液，切记要转膜夹的黑色对着黑色负极，倒另外，转膜装置中有个空间可以放置一个小冰盒或者小冰袋，目的也是吸收转膜时产生的热量。

6．将整个转膜装置放在冰浴中，接上电极，90V恒压，根据目的蛋白分子量的大小决定转膜时间，一般140分钟。

冰浴：

接上电极

冰浴：

转膜结束后，切断电源，取出PVDF膜

三：封闭

1．配置TBST缓冲液：含0.1% Tween 20 的TBS缓冲液（100mM Tris-HCl PH7.5，150mMNaCl）。

2．配置封闭液：用TBST缓冲液配置5%脱脂奶粉or BSA，一般脱脂奶粉现用现配，BSA可以回收反复利用。

3．将膜置于封闭液中室温摇床上，封闭1-2h。

四：一抗孵育

1． 配置：用一抗稀释液稀释一抗（比例用购买抗体带的说明书建议的稀释比例）。

2． 将膜置于稀释后的一抗中，4度摇床孵育过夜。

3． 洗膜：孵育结束后，用1XTBST室温洗3次，每次15分钟。

五：二抗孵育

1． 配置：用1%的BSA液体稀释二抗（比例看说明书，种属根据一抗的抗性选择，如一抗为鼠抗，那么二抗就用抗鼠的）。

2． 将膜置于稀释后的二抗中，室温孵育1h。

3． 洗膜：孵育结束后，用1XTBST室温洗3次，每次15分钟。

六：生物发光显色

注意事项：

1． Tween 20比较粘稠，可以先讲枪头剪掉一部分，在进行吸取。

2． 转膜时也可以用恒流转，一般用160mA，为了保证转膜装置的寿命，无论是恒流还是恒压，转膜的电流都不要超过200mA。

3． 转膜结束后，转膜装置应当在水中浸泡一段时间，防止过多的盐沉积在铂丝上。

4． 稀释后的一抗可以回收利用，提高使用次数。

5． 转膜液也可回收利用，当转膜电流为160mA时,电压为70-80V，电流为200mA时，电压显示为90-100V，说明转膜液可以使用。

Western Blot（蛋白免疫印迹技术）介绍完啦，以后给大家介绍其他实验！敬请期待吧.......

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