重组表达质粒的构建

内容发布更新时间 : 2023/4/9 19:35:23星期一 下面是文章的全部内容请认真阅读。

重组表达质粒的构建——原核表达载体选择

质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。

蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。 1）促表达/促溶标签

标签名称 GST标签（谷胱甘肽-S-转移酶） MBP标签(麦芽糖结合蛋白标签) SUMO(小分子泛素样修饰蛋白) NusA(氮素利用物质A) Trx(硫氧还原蛋白) GB1（Protein G核心结构B1）

2）信标标签 标签名称 Halo标签 AVi标签 结构 300aa 15aa 标签功能 脱卤素酶的遗传修饰衍生物。 标签小不影响空间结构；重组蛋白被生物素连接酶生物素化，实现体内氧化温和标记。 SNAP标签 182aa 多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。 SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。 标记物可以深入细胞，适合细胞标记。

R pFrd-SNAP质粒 Frdbio○Frdbio相关产品 R pFrd-Halo质粒 Frdbio○R pFrd-Avi质粒 Frdbio○结构 211aa 396aa 98aa 495aa 109aa 56aa 的作用。 增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白 分子伴侣，提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性。 主要功能 可以利用它增加外源蛋白的可溶性；提高表达量Frdbio相关产品 R pFrd-GST1质粒 Frdbio○RpFrd-GST2质粒 Frdbio ○R pFrd-MBP质粒 Frdbio○ R pFrd-SUMO质粒 Frdbio○ R pFrd-NusA质粒 Frdbio○R pFrd-Trx质粒 Frdbio○R pFrd-GB1质粒 Frdbio○促进重组表达蛋白的可溶性 避免包涵体的形成 促进表达蛋白的可溶性 3）纯化标签

我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。 标签名称 组氨酸标签（His-Tag） 标签结构 6-10aa( His) 纯化配体 固化金属离子：镍、钴、铜、锌 Frdbio相关产品 R Ni NTA Beads Frdbio○R Co NTA Beads Frdbio○R Cu IDA Beads Frdbio○R Zn IDA Beads Frdbio○GST标签（谷胱甘肽-S-转移酶） FLAG标签 211aa 8aa（DYKDDDDK） 谷胱甘肽树脂 抗FLAG单抗 R Frdbio○Glutathione Beads RAnti-Flag单抗 Frdbio○Frdbio R○Anti-Flag Affinity Beads Strep-II标签 Protein A(葡萄球菌A标签) MBP标签(麦芽糖结合蛋白标签) CBP(钙调素结合蛋白标签) CBD(几丁质结合结构域蛋白) Halo标签(33KDa)

4）酶切位点 酶切位点 Thrombin Factor Xa Enterokinase(肠激酶) TEV protease 切割位点 Leu-Val-Pro-Arg▼Gly-Ser Ile-Glu/Asp-Gly-Arg▼ Asp-Asp-Asp-Asp-Lys▼ Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln▼Gly Frdbio相关产品 8aa（WSHPQFEK） 280aa 396aa 26aa 51aa 300aa Strep Tactin 固相IgG 交联直链淀粉 固相钙调蛋白 几丁质 氯化烷烃 FrdbioR○ Streptactin Beads FrdbioR○ IgG Beads FrdbioR○ Dextrin Beads FrdbioR○ Streptactin Beads Chitin Beads HaloLink Beads RTEV protease Frdbio○R 3C Protease Frdbio○PreScission( HRV 3C Protease) Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln▼Gly-Pro SUMO Protease (UBL) protein, SUMO recognize the tertiary structure of the ubiquitin-like 以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。

标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。

在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。