质粒与载体

六、质粒的宿主范围(host range)

质粒间的宿主范围有很大的差异。能在多种不同菌属的细胞中生存的质粒称为泛宿主性质粒，如RP4和RSF1010；只能在单一或极为相近的宿主中生存的质粒称为狭宿主性质粒，如F-质粒和ColE1。质粒的宿主范围与其复制所需要的条件和质粒本身所携带的基因有关。如果一个质粒携有与本身复制有关的基因，而这些基因的启动子又是最容易启动的，那它对宿主的需求自然很少，它的宿主范围当然很广。如RP4在几乎所有的革兰氏阴性菌中都能生存。相反的，一个对宿主需求很多的质粒，对宿主的依赖自然很强，它的宿主范围当然很窄。如F-质粒只能在大肠杆菌中生存。

七、质粒的结合生殖(conjugation)

有的质粒具有在细菌细胞间进行结合生殖的能力，这些质粒称为结合质粒(conjugative plasmids)或自动转移质粒(self-transmissible plasmids)。质粒的结合生殖过程包含了细菌细胞间的结合与质粒的DNA 复制。与质粒结合生殖有关的基因很多，其中包括主持其事的基因和许多调控结合生殖的基因。这些基因在不同的质粒系统中各有其名，但多数被命名为tra(Transfer)或mob(mobility)，如traA、tra、mobA、mobB等等。一个结合质粒至少要具有下列三个基本条件：1.产生性线毛(sex pili)的能力、2.具有转移原oriT(origin of transfer)及3.能辨认oriT的特殊DNA 内切�(DNA endonuclease)。

结合质粒有产生线毛蛋白(pilin)的基因，线毛蛋白产生后组成性线毛。虽然性线毛因来源质粒不同而有F-线毛(来自F-质粒)、R-线毛(来自R-质粒)等之分，但在功能上它们的作用都是用来刺激细菌细胞使之结合。含有结合质粒能产生性线毛的细菌细胞称为雄型(male type)或正型(+ type)；不含结合质粒无性线毛的细菌细胞称为雌型(female type)或负型(- type)。结合生殖时正型称为授株(donor)；负型称为受株(recipient)。结合生殖的结果使负型变为新的正型，此时新的正型称为transconjugant(有些情况称为exoconjugant)。

质粒在结合生殖时要靠特殊的DNA 内切�将质粒DNA 中的一股在特定的地方切成单链，然后将切成单链的一股DNA 经由两个细胞的结合处传送到受株中，同时以rolling circle方式完成各股DNA 的复制。质粒DNA 中被切开的特定的地方就是oriT或称为bom(basis of mobility)、nic(nick site)，它们具有一定的DNA 序列。切oriT的DNA 内切�有时称为nickase，它是tra基因中之一的产物。每一类的oriT均有它特定的DNA 内切�，并且内切�应该切oriT处的哪一条链及哪两个碱基之间也是一定的。

非结合质粒中有些因为具有oriT或bom，所以可以经由具tra基因的helper质粒协助而被传送。可被传送的非结合质粒称为可移动质粒(mobilizable plasmids)，pBR322就属于这个类型；不可被传送者称为不可移动质粒(non-mobilizable plasmids)，RSF1010属这一型。可移动质粒与helper质粒的搭配使用在基因转殖上是常被利用的技术。

结合质粒F上有若干个与大肠杆菌染色体上相同的转位子。在偶然的状况下因为相同DNA 序列的转位子发生同源重组(homologous recombination)，结果使F-质粒与染色体DNA 融成一体。这种授株被称为Hfr(high frequency of recombination)。当Hfr的F-质粒做结合生殖时，整个与其黏合的大肠杆菌染色体会依序地被传送到受株中。大肠杆菌的基因图谱就是靠这种方式完成的。你也可以利用泛宿主性结合质粒在其它菌种中做类似的工作，但因DNA 定序技术的高度发展已使得这类工作显得费时与不够精确了。

八、载体(vector)

载体的主要功能在基因选殖(cloning)，选殖的主要目的是分离、纯化及繁殖特定的基因。细菌性载体主要有质粒载体(plasmid vector)和噬菌体载体(phage vector)两种，我们这里所谈的以质粒载体为主。质粒载体的基本条件是：1.它们是复制体，能生生不息地被复制；2.它们有适当的标示基因，可供做转形株(transformant)和非转形株(non-transformant)的辨识；3.它们有另一组具有限制�单切点的标示基因，可供插入外来基因并做为选殖株(clone)和非选殖株(non-clone)的辨识。此外它们的基因体要小，以便于操作和细胞转形。

利用质粒发展成载体第一个最成功的例子是pBR322(Bolivar et al, 1977)。它含有pMB1的复制原、pSC101的抗四环霉素(tetracycline)基因tet和Tn3(一种转位子)的抗青霉素(penicillin)基因bla。你可以把外来基因插在这两个抗药基因中的任何一个内，利用中断抗药基因的消失做选殖筛选，利用剩下的一个完整抗药基因做转形株筛选。因为pBR322的成功构筑，才使基因选殖有了长足的进展。

细胞转形(cell transformaiton)是基因选殖的重点工作之一。但细胞的转形率与外来DNA 的大小成级数反比。以几万碱基对大小的DNA 来转形大肠杆菌细胞几乎是不可能的。为了改善这种情况，结合了pBR322的载体特性和噬菌体λ(lambda)的壳蛋白包裹(packing)特性发展出cosmid pHC79 (Hohn and Collins 1980)。噬菌体λ的基因体由48,502个碱基对构成。它在宿主中的DNA 复制产物是多个λ基因体相连的多元体(concatemers)。当噬菌体壳蛋白接近完成时才将λ基因多元体由一端「吸入」。当壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体75%的DNA (约36,000碱基对)时，一个特殊的λ DNA 内切�开始被活化并寻找适当的切点以便切开λ基因多元体完成包裹动作。如果壳蛋白已经包裹了约相当于λ基因体110%的DNA (约54,000碱基对)还没发现适当的切点时，包裹动作就会被放弃。这个「适当的切点」平时就在线状λ基因体DNA 的两端，称为 cohesive sites (cos)。将噬菌体λ的cos切出植入pBR322中使新构筑的载体兼有质粒载体与可被视为λ基因体而被包入λ壳蛋白中的特性，可使30,000~50,000碱基对大小的DNA 轻易地被选殖出来。因为它结合了λ cos site和plasmid，故称为cosmid。

载体pUCs(如pUC18、pUC19，Yanisch-Perron et al, 1980)则是利用pBR322做了选殖株筛选的进一步发展。它的特点是利用了呈色基因取代了pBR322中的一个抗药基因。大肠杆菌乳醣分解�(β-galactosidase)可分解许多β-半乳醣化合物(β-galactoside)，其中也包括了X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)。X-gal呈淡黄色，分解后呈蓝色。大肠杆菌的乳醣分解�有两个不寻常的特色：1.该酵素N-端的廿几个氨基酸和酵素活性无关，可以任意修改成连串的限制�切点MCS (multiple cloning site)而不影响酵素活性；2. .该酵素基因如果被适当地分成两段(如前段lacZ’和后段lacZΔM15)，这两段基因的产物(α-chain和β-chain)尚能互补而具有酵素活性。载体pUCs利用了pBR322的基本骨架，以突变除去抗青霉素基因中的PstI切点，切除抗四环霉素基因并在该处加入具有MCS的lacZ’。至于后段的lacZΔM15则是利用F-质粒或噬菌体带入乳醣分解�缺失型的大肠杆菌中。利用了这种载体与宿主的基因互补，pUCs改善了选殖株筛选的方式。何况在培养基中加乳醣分解�基因的诱发物(inducer)IPTG(isopropyl-1-thio-β- D-galactopyranoside)，更可诱发乳醣分解�大量表现。你只要看颜色就能鉴别选殖株与非选殖株。