转需！影响人多能干细胞质量的因素有哪些？如何监测细胞质量？

2019年ISSCR上，WiCell Research Institute（下文中简称为WiCell）发表了一篇关于人多能干细胞（hPSC）质量的poster，文中强调了细胞质量对研究的重要性。低质量的细胞会影响实验结果的重现性、导致错误的实验结论、浪费时间、消耗资源。

WiCell一共收集了来自31个不同实验室的1732株iPS细胞系，截止到poster发表之日，一共有839株细胞系已经完成检测，并且这839株细胞系已被提供给了更多的科研机构和院所，但令人震惊的是，其中超过1/3的细胞株（285株细胞系）未通过WiCell的常规细胞质量测试！WiCell进行的细胞质量鉴定项目（括号内为实际检测机构），包括

● 解冻复苏及使用光学显微镜观察的自发分化（WiCell）

● 核型检测：G-banding（WiCell）

● 均一性：使用Promega PowerPlex 16 HS System检测Short Tandem Repeat (STR) （UW‐Madison Hospitals and Clinics）

● 无菌测试（Bacteriostasis/Fungistasis）：使用direct transfer method进行14天的培养（Steris）

● 支原体检测：使用Lonza Mycoalert或Biological Industries EZ PCR Mycoplasma Kit（WiCell）

如上图所示，这285株未通过细胞质量标准的原因如下：

● 61%的细胞系的核型发生改变，其中54%的核型异常原因为recurrent abnormalities，balanced translocation出现的核型异常占20%。

● 10%的细胞系发生STR异常，包括细胞系的交叉污染、身份错配或性别错配。实际情况可能更为严重，由于某些同一性别的特定细胞系也可能被错误识别而未能检测出。

● 超过25%的细胞系（80株以上）冻存后无法复苏，或无法进行贴壁、无法扩增或是分化区域太多。

● 12株细胞系未通过无菌测试，1株细胞系支原体检测阳性。

由此可见，细胞质量对hPSC研究至关重要，获得高质量的hPSC是研究成功的必要条件，而在日常对hPSC进行维持培养的过程中也应选择高质量的hPSC培养基并定期对细胞进行质量监控。

影响细胞质量的因素

稳定的pH

培养环境中的刺激物（例如乳酸、活性氧、以及代谢产物的积累）会对DNA造成损伤，增加遗传信息异常的可能性。pH的变化是决定细胞培养质量的最主要因素之一，细胞外环境的pH低于7.0会降低糖酵解的速率，而如果pH低于6.9则会显着增加DNA的损伤。最近的研究表明，培养基的酸中毒可能与DNA损伤，基因组不稳定性和生长停滞增加有关。此外，实验证明，降低培养基酸度可减少细胞的凋亡。我们发现，当pH在7.2-7.4的范围内，hPSCs的培养效果最佳。STEMCELL的mTeSR™ Plus通过采用了更优化的缓冲体系，能够长时间保持培养环境pH高于7.0，确保优质的细胞培养质量。

图1. mTeSR™ Plus在Weekend-Free的方案下维持了最适宜的pH水平

使用mTeSR™ Plus在日常维持培养期间的任何时间都可以跳过2天换液，同时保持pH值高于7.0。

图2. 在mTeSR™ Plus中使用restricted换液流程（减少换液次数）维持培养的hPSCs保持正常的核型 

人ES（H1）和iPS（WLS-1C）细胞在mTeSR™ Plus中培养15代。使用（ A）hPSC基因检测试剂盒在p5，p10或p15（图中为p15）和（B）G-banding在p30均未检测到核型变异。

稳定的FGF2

干细胞培养的一个重要方面是维持干细胞的未分化状态，mTeSR™ Plus对培养基成分进行了多重优化，使用了更稳定的组分（包括FGF2），一次换液能够保持长达72小时的细胞稳定，而无需更换培养基。

图3. mTeSR™ Plus在Weekend-Free的方案下维持了稳定的FGF2的水平

37℃培养72h，mTeSR™ Plus中的FGF2依旧维持高水平。使用ELISA检测。

如何监测细胞质量？

明确的hPSCs克隆形态

均一的，具有确定边界，和密集的克隆是细胞高质量的指标。发亮的密集中心表示健康的克隆适宜进行传代。

多能性验证

hPSCs的多能性是将它们用于再生医学和组织工程学的关键。多能性指的是细胞分化为不同细胞类型的能力。这意味着可靠地获得、培养和维持完全多能性干细胞会对实验的结果造成了极大的影响。hPSCs向三胚层的分化潜能可通过多种方法进行评估。现有的检测方法包括畸胎瘤检测与类胚体分化，但它的实验周期长，成本高昂且不稳定。基于此，STEMCELL研发出STEMdiff™三谱系定向分化试剂盒，提供了一种简单、具重复性的方法检测新建或已建立的人ES和iPS细胞向外胚层、中胚层和内胚层分化的能力。三种谱系的分化同时进行，检测可在一周之内完成，使得多能性检测相比之前更为快速、易用且准确。

图4. STEMdiff™三谱系定向分化试剂盒检测流程

遗传学检测

如上文中WiCell数据所示，绝大部分iPS不符合细胞质量的标准是由于核型的变化。hPSCs在常规培养期间会以非随机和零星的方式获得核型异常。这些细胞遗传学变化背后的机制仍未可知。hPSCs中最常受影响的染色体包括1,8,10,12,17,18,20和X，而在人类癌症中也观察到许多这些复发性异常，带来了将这些细胞用于治疗应用的安全性问题。而由hPSCs培养不当而产生的核型异常，会极大影响实验的准确性。而STEMCELL研发的hPSC Genetic Analysis Kit（hPSC基因检测试剂盒）包括用于检测报道过的人ES和iPS细胞中大部分的核型异常的引物和探针。试剂盒基于qPCR技术研发，可高效且性价比极高的进行多种人ES和iPS细胞系的筛查，速度快，成本低且灵敏度高。如下图所示，染色体20q11.21的扩增为一种亚核型异常，因此难以被传统的核型检测手段（如G显带）检测出。而染色体20q11.21的增加导致 一些基因的拷贝数增加，包括BCL-XL，具有这些突变的hPSCs拥有强大选择性的增殖优势。

图5. hPSC基因检测试剂盒检测出染色体20q11.21变异

使用（A）hPSC基因检测试剂盒检测出iPS细胞系WLS-4D1中染色体20q重复，而（B） 使用G显带并未测出，需要通过（C）荧光原位杂交（FISH）使用针对20q11（绿色）和 20q11.21（红色）的探针证实。

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（文章来源于STEMCELL ，作者Ariel）