细胞裂解液成分及类型

1.     裂解液成分了解：

（1）大多有效成分都是去垢剂，那么去垢剂是什么呢？

去垢剂功能的关键是具有两亲结构。所有的去垢剂都具有亲水“头部”区域和疏水“尾部”区域这一特征，常用的阴离子去垢剂SDS结构如图：

这些结构特性使得去垢剂可以在水性介质中聚集。在足够高的浓度下，每个分子的极性亲水区域朝向极性溶质（水），而疏水区域聚集在一起，形成一个具有疏水核心的热力学稳定的胶束。去垢剂胶束的疏水核心区域与蛋白质的疏水表面结合，形成可溶性的蛋白质-去垢剂复合物。

去垢剂根据其亲水基团的不同分为：阴/阳离子去垢剂、非离子型两性去垢剂、两性去垢剂。

a 阴/阳离子型去垢剂：作用强烈，会更大程度的改变蛋白质的结构，更容易受到pH、离子强度和反离子的性质等因素影响；

b 非离子型去垢剂：作用温和，由于不分离蛋白质-蛋白质键，非离子型去垢剂使得蛋白质可以保留其天然的结构和功能，不易变形（疏水链长度较短的去垢剂更易引起蛋白质失活）；

c 两性去垢剂：相对于离子型去垢剂其更少产生变性，相对于非离子型去垢剂，又可以更有效的破坏蛋白质-蛋白质键并减少聚集。

（2）配置裂解液都需要Tris缓冲液，又是什么呢？

a. Tris学名叫三羟甲基氨基甲烷，它和Tris-base是一个东西，1M的Tris溶液的pH值大约是10～11，即常说的Tris碱；

b. Tris-cl和Tris-HCl是一个东西，就是写法上有所不同，即常说的Tris酸；

c. Tris-HCl就是在Tris-base的溶液中加入适当量的盐酸，调成你所需要的PH值。

2.    常用裂解液种类：

（1）NP40 lysis buffer：

a. 主要成分50mM Tris(pH7.4)，150mM NaCl，1% NP-40。

b. 概述：NP-40是一种很温和的非离子型去垢剂，1%浓度基本可以破坏掉细胞膜，而对核膜的破坏作用较弱，结合特定的缓冲液可以获得胞浆蛋白。与蛋白结合力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。

c. 用途：常规的Western、IP和co-IP和ELISA，本实验室是做核蛋白的，由于获取核蛋白需要裂解细胞核膜，因此本lab WB实验用1%NP40+0.1%SDS（可使蛋白变形），IP/pull down实验用1%NP40+超声（保留蛋白结构）。

（2）SDS lysis buffer：

a. 主要成分：50mM Tris (pH8.1)，1% SDS

b. 概述：是一种比较强烈的细胞组织裂解液，可裂解核膜。在SDS-PAGE电泳中，SDS能使蛋白氢键和疏水键打开并结合蛋白分子，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度电荷且远远超过蛋白分子原有电荷，从而掩盖蛋白间电荷差别，使得电泳迁移率只取决于分子大小这一因素。

c. 用途：用于常规Western、ChIP等

各种常用裂解液的比较推荐参考碧云天网页：https://www.beyotime.com/lysis-buffer.htm

 用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。    对于绝大部分的Western检测Western及IP细胞裂解液(P0013)和RIPA裂解液(强)(P0013B)都能取得非常理想的裂解效果，后续的检测效果已经有数百篇文献证实。RIPA裂解液(强)(P0013B)的操作比Western及IP细胞裂解液(P0013)略麻烦一些，但裂解效果略强一些。    对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。    对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。    对于这些裂解液是否需要添加适当的蛋白酶和磷酸酶抑制剂的问题，除了两种不含抑制剂的裂解液需要根据特定使用目的酌情考虑外，其余的裂解液在常规操作时，我们推荐添加PMSF(优先推荐更易使用的ST506，其次推荐ST505)，该抑制剂比较廉价但会进一步改善蛋白酶的抑制效果；如果样品非常宝贵希望非常高效地保证裂解样品的质量，推荐添加蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(P1045-P1066)，确保蛋白不被降解蛋白磷酸化水平也能被保留；如果不涉及磷酸化蛋白，可以仅添加蛋白酶抑制剂混合物(P1005-P1031)；从成本角度考虑，如果添加PMSF后蛋白降解的问题能被有效控制，但蛋白磷酸化水平不太稳定，可以考虑同时再添加磷酸酶抑制剂混合物(P1081-P0197)。    对于涉及蛋白乙酰化检测的情况，需要添加去乙酰化酶抑制剂混合物(P1081/P1082)。通常需要在裂解液中添加去乙酰化酶抑制剂混合物(P1081/P1082)，同时根据实验设计，有时在培养细胞和组织时就需要添加适量的去乙酰化酶抑制剂混合物(P1081/P1082)，以累积乙酰化蛋白，便于后续的检测。