《中国输血行业发展报告（2022）》我国血型基因检测技术发展现状与展望

血型基因检测技术主要涉及到样本核酸的提取、各种PCR扩增技术、碱基的标记和分子检测方法，以及核酸序列和氨基酸序列的分析方法、抗原表位的构象模拟和解读结果的临床意义。

下面根据几种主要血型基因检测技术在国内使用的广泛程度和内在的逻辑联系说明当前的发展状况。

1、序列特异性引物PCR（PCR-SSP）

序列特异性引物PCR（sequence specific primer，PCR-SSP），有时也称为SS-PCR，或者等位基因特异性PCR（allele specific, AS-PCR）。PCR-SSP需要设计针对靶标等位基因的特异性引物，加上两个等位基因共有的引物。PCR产物在琼脂糖凝胶电泳后用成像设备拍照，比较产物的片段长度即可识别是否有突变位点对应的等位基因扩增。PCR-SSP技术相当成熟，不需要昂贵的仪器设备，在国内应用较多。存在多种商业化试剂盒可以检测ABO 、RHD和RHCE等基因的主要序列，如ABO*A2.05、ABO*O.01.01、RHD*01EL.01 和RHD*01等。

2、实时荧光定量PCR(RT PCR)

实时荧光定量PCR法（real-time PCR，RT PCR；或者 quantitative PCR，qPCR）测量每个扩增循环后体系的荧光，实时监控反应过程。可用与DNA双链结合的染料分子SYBR Green，发出的荧光强度与PCR产物数量相关，加入内参对照，分析熔解曲线，即可区分目标片段和非特异性产物，这是血型基因分型常用的方法。如果靶点较多，则使用含有荧光报告基团和猝灭基团的TaqMan探针，每种探针的荧光波长不同，识别到目标等位基因并与之结合，即可发出的特定荧光，可检测的靶点一般为两到四种。

3、高分辨率熔解曲线分析（HRM analysis）

高分辨率熔解曲线分析（high resolution melting analysis，HRM analysis）技术将纳克级别的样品放在毛细管中，使用饱和染料，反应的熔解速率可达5.0°C/秒，采集高分辨的数据，能够进行突变扫描和基因分型，如判断RHD基因的合子类型。与使用TaqMan探针的方法相比，较为经济有效。

4、聚合酶链反应-直接测序分型(PCR-SBT)

桑格法测序（sanger sequencing）也称为双脱氧测序法（dideoxy sequencing），常用含有荧光标记的双脱氧核苷三磷酸（dideoxynucleoside triphosphate，ddNTP）进行链终止的PCR反应，结合基于毛细管电泳的自动测序仪识别管路上不同颜色标记的碱基（A、C、T和G），即可获得核苷酸序列，检测长度可达900 bp。桑格法是一代测序，结果较为准确，通过软件与标准序列对比，可显示位点的变化。桑格法测序可以分析各种突变形式，识别等位基因，发现新的突变，是国内在血型基因检测方面应用较为普遍的测序法。

5、下一代测序技术(NGS)

下一代测序技术（next-generation sequencing，NGS），还可称为二代测序技术（second-generation sequencing）、大规模并行测序技术（massively parallel sequencing，MPS）或高通量测序技术（high-throughput sequencing），此类技术先扩增基因组DNA的随机片段，同时检测多个孔道的信号，再通过软件拼接大量的数据结果，获得待测的模板序列。二代测序具有高通量、高灵敏和高准确度的特点，费用较高，国内在HLA分型方面应用较多。也有少量研究工作使用NGS技术，在建立ABO基因全序列文库的基础上，靶向捕获目标等位基因片段，实现ABO基因的分型。

6、基因芯片检测技术

基因芯片技术是将多个血型系统的多个靶点集中到一个芯片上，形成阵列，然后用荧光显微镜进行检测信号，即可实现半自动的基因分型。国内有进口相关设备开展这方面的检测，例如BeadChip平台对红细胞抗原的检测，经过扩增、纯化、解链和杂交等步骤，一次实验就可识别11个血型系统中的38种抗原；或者一次性检测22个血小板抗原的SNP状况。另外一种进口的Bloodchip平台基于Luminex液相芯片技术，也有少量相关研究，检测靶标大同小异。基因芯片技术具有高敏感和多位点检测的优势，适合批量样本基因型的筛选。

7、限制性片段长度多态性技术(RFLP)

限制性片段长度多态性技术(restriction fragment length polymorphism， RFLP)用限制性内切酶切割PCR产物，再通过电泳分离，获得特异的DNA片段图谱。国内在ABO基因分型、HLA位点识别和血小板基因分型等方面都有应用。类似于一种DNA指纹，与血型基因相关的分析也可用于法医学鉴定。

8、短串联重复序列 (STR)和数目可变重复序列（VNTR）

短串联重复序列 (short tandem repeats，STR)是一种微卫星DNA（microsatellite DNA），重复单元长度一般为2-10bp。可变数目串联重复序列（variable number tandem repeats，VNTR）为一种小卫星DNA（minisatellite DNA），重复单元长度为10-60bp。STR片段较短，多态性程度高，可针对多个位点设计荧光标记的引物，进行多重PCR扩增和毛细管电泳检测，鉴别能力强，应用广泛。VNTR片段可以用限制性内切酶提取，并通过RFLP分析，也可通过PCR扩增，然后电泳分离检测。STR和VNTR通常在非编码的内含子区域，是一种分子遗传标记，国内应用在个体识别和亲子鉴定方面较多，可分析血型遗传关系、异基因造血干细胞移植和等位基因的缺失等。

9、多重连接探针扩增技术（MLPA）

多重连接探针扩增技术（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）针对每个靶序列设计一对位于两侧的探针，只有当左右探针都匹配时，才能进行连接反应；后续PCR用通用引物扩增探针序列，分析不同的探针对，获得靶序列的信息。MLPA可同时检测多个位点，是一种高通量和高灵敏的技术，适合血液中心的筛查。国内在多种红细胞抗原的基因分型，尤其是RHD、RHCE和MNS的分型方面有较多研究。

10、SNaPshot技术

SNaPshot技术使用荧光标记的ddNTP进行单碱基延伸反应并终止，引物与目标SNP对应，再用测序仪分析峰的位置和颜色即可确定掺入的碱基，获得样本的基因型。这是一种多重分析系统，单管可运行10 对引物模板组合。目前应用在ABO、Duffy和HNA等系统的基因检测，例如可识别多种ABO亚型。

11、其它技术

国内部分大学和研究中心有自己实验室开发的检测（laboratory-developed tests，LDT），针对感兴趣的基因展开研究，并发展实验方法，例如某血型基因检测联合参比实验室开发的稀有血型基因分型方法、某血液中心用单细胞巢式PCR技术检测RHD基因。还有些使用降落PCR ( touchdown PCR，TD-PCR)提高特异性扩增，促进分析；有些使用GAP-PCR法检测地中海贫血相关基因。

其它检测技术，例如等位基因特异性液滴PCR（Droplet-AS-PCR）、数字PCR（dPCR）、多肽核酸的熔解曲线分析（fluorescence melting curve analysis，FMCA)、单链构象多态性聚合酶链反应（PCR-SSCP）技术、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）技术等，国内在血型基因检测方面较少应用，有待研究和探索。

二 实验室和仪器设备

进行基因检测需要专业的PCR实验室或者基因组学实验室。

进行基因检测需要专业的PCR实验室或者基因组学实验室。基因扩增检验实验室的平面布局、系统设置、配套设施、管理制度、标准化操作程序和质量管理体系文件等都要符合国家相关PCR实验室的设置要求，做到实验室日常安全稳定的运转，从而保证检验结果的质量和保障实验室的生物安全。

根据实验室需要配备超净工作台和生物安全柜。主要仪器设备包括不同量程的移液器、全自动核酸提取仪、PCR扩增仪、凝胶电泳仪和成像设备。少数实验室有桑格法测序仪、高通量测序仪和基因芯片检测成套设备。

在完善的人才队伍、齐全的设备和足够的场地资源的基础上，目前有建立血型基因检测联合参比实验室，可进行ABO等大多数血型系统的基因分型和测序；也有血液中心设立的疑难血型基因检测开放平台，可开展ABO、RHD、血小板CD36和稀有血型等方面的分子生物学检测工作。

三 软件系统

(一) 数据采集和序列分析软件

PCR仪配套软件记录时间、温度、循环次数、荧光信号强度等数据，测序仪配套软件记录时间、序列峰值等。DNA序列分析常用ChromasPro、Clustal、Oligo、Geneious、DNAMAN、Genemapper等软件。还有些使用NCBI提供的在线分析工具BLAST。氨基酸序列的分析和蛋白质分子的可视化，主要用到Chimera、PyMOL、VMD (visual molecular dynamics)等软件。

(二) 统计分析软件

一般采用不同版本的SPSS统计软件对批量结果进行分析，如各种基因多态性的地域差异、等位基因在不同人群的分布频率等；少部分研究工作用Stata、SAS 和Excel进行统计。

(三) 血型基因相关数据库

国内目前一般以国际输血协会（International Society of Blood Transfusion，ISBT）公布的数据表作为参比。到2021年6月为止，被ISBT红细胞免疫遗传学和血型术语工作组认可的血型系统为43个，其中包含由48个基因决定[1]的345个红细胞抗原。同时维护其它分子基础尚未研究明确的血型集合，700系列低频抗原和901系列高频抗原的相关数据。前期的研究可使用美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的血型抗原基因突变数据库（Blood Group Antigen Gene Mutation Database，BGMUT）。也有些使用Erythrogene数据库进行在线查询。

四 行业标准

中国合格评定国家认可委员会于2021年5月发布《医学实验室质量和能力认可准则的应用要求》（CNAS-CL02-A001），指导医学实验室质量体系的建立和能力评估。2021年8月，国家卫生健康委员会发布《人类白细胞抗原基因分型检测体系技术标准》（WS/T 785-2021），指出了HLA基因分型检测技术体系的规范及要求，涵盖人员、实验室、主要技术方法等。2021年10月，中国输血协会发布团体标准《红细胞血型基因分型技术指南》（T/CSBT 009-2021），说明了红细胞血型基因检测不同阶段的技术要求和质量控制。随着相关标准的发布，血型基因检测更加规范。

五 新技术开发成果举例

(一) 基因检测试剂盒

目前国产的基因检测试剂盒主要有基于PCR-SSP法和荧光PCR法的ABO基因分型检测试剂盒和RH基因分型检测试剂盒；还有用荧光PCR法的稀有血型基因分型试剂盒，可在一次实验中检测RH、LW、FY、JK、MNS、SC、CO、DO、KEL、DI、YT、LU十二个血型系统的32个有临床意义的位点。

此外，新型的HLA-HPA表位匹配试剂盒也开始规模应用，第一代产品用PCR-SSP法，用于患者和血小板供者的HLA表位和HPA配型，可提高匹配率，减少血小板输注无效。第二代产品采用多重荧光PCR法，单管检测多个靶点，使用的样品量更少，效率更高。

(二) 数据库系统的开发

随着人类血型数据库（dbHBG）的建立和稳定运行，已经可以在线查询血型基因各项基础数据，包括ISBT、BGMUT的数据，还有近期文献、实验室检测结果等数据提供参比，以促进国内在血型基因领域的研究和开发工作。

多个血液中心也在探索成立血小板基因库协作组，确定区域性的血小板供者数据库，一定范围内共享检测技术和相关数据等，以解决免疫性血小板输注无效。

(三) 芯片检测系统的开发

部分小组在进行以荧光显微镜为基础的血型基因检测芯片系统的研发，通过设计多种荧光探针，结合微芯片阵列，实现一次进样检测多个血型系统的等位基因，预测有重要临床意义的抗原表型。

还有小组以Luminex液相悬浮芯片检测系统为基础，设计匹配试剂，检测ABO、RH、JK等几个血型系统的主要基因位点，并录入电子配血系统，尝试临床应用。

(四) 新的变异位点和等位基因的发现

在血清学检测和一代测序数据的基础上，部分血液中心和输血科室发现了新的变异位点和等位基因，有些经过TA克隆测序验证了单倍型。2021年在AABB的期刊Transfusion新的等位基因栏目中的报导有14篇，主要针对ABO、RHD和RHCE基因，有个别在A4GALT和GYPA基因。

六 展望

根据2020年统计，我国有三级医院近2996家，基本都有独立的输血科，各级采供血机构包括血液中心、血站约606家[2]。在输血医学领域，其它还有一些高校、研究机构和企业实验室。目前具备DNA提取、PCR扩增、血型基因分型和测序能力的实验室仅有几十家，其它实验室的测序样本一般外送，新的PCR实验室在建设中。

血型基因检测技术的理论基础是分子免疫血液学，还牵涉到分子生物学、生物信息学和医学遗传学等多个学科，难点在于多学科的交叉，需要配备多个专业方向的人才队伍。

到2022年2月，我国在血型基因检测技术的开发和应用方面进行了诸多尝试和探索，取得了较好的成果，例如全国多中心研究项目的开展、数据库的建立和数据分析的突破，也发现了一些新的变异位点、新的等位基因。但仍处于起步阶段，以后血型基因检测会逐步走向临床应用，在新的抗原发现方面可能有所突破。随着采供血机构、医疗机构的输血科和相关企业对研发的更加重视，各方面投入都在增加，拟开发一些新技术和新产品，血型基因检测具有较好的发展前景。

[1]https://www.isbtweb.org/isbt-working-parties/rcibgt.html

[2]吴士勇 总编，中国卫生健康统计年鉴，中国协和医科大学出版社，2021，第8、13页。

（完）

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