酶的提取、分离、纯化及其活力测定

（三）酶活力的测定

酶的活力表现为催化某一反应的速度，反应速度越大，酶的活力也越大，酶催化的反应速度可以用单位时间内底物的消耗量或产物的积累量来表示。由于酶的催化作用和周围环境的关系十分密切，环境的温度、pH、离子强度等都对酶的活力有很大的影响，因此测定酶活力时应该使这些条件保持恒定。 　　酶活力的大小常以每mg酶蛋白每分钟所分解的底物量（或生成的产物量）μmol数表示之。测定酶活性的方法很多，常因反应的底物和产物的性质不同可选用不同的方法，应用最广泛的是比色法或分光光度法。凡反应系统中的化合物在紫外区或可见光区有吸收峰的都可以用这种方法进行测定。如果酶催化的是一需氧反应，如氧化酶，则可用测压法或氧电极法。如果催化的反应系统中需要ATP或产生ATP，如一些激酶；或是有NAD存在，如一些脱氢酶和氧化还原酶；或者反应产生H2O2，如一些氧化酶，这些酶的活性可以用生物发光或化学发光方法进行测定。总之，测定酶活性的方法很多，应根据具体情况选择合适的方法。

三、材料、仪器与试剂

要求用硫酸铵分级沉淀部分纯化过氧化物酶。

（一）、材料：花椰菜根

（二）、仪器（仪器的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定）　　冰冻离心机；751型分光光度计；电磁搅拌器；组织捣碎机；天平；量筒；移液管；烧杯；透析袋。

（三）、试剂（试剂的选择在实验开始前由学生在预习报告中提出方案后教师审定后并配制）　　PVPP；硫酸铵；0.02mol/L KH2PO4溶液；0.lmol/L 磷酸钾缓冲液，PH6.0。

四、实验操作

（1）酶的提取：取花椰菜根（或其他植物材料）用自来水洗净，吸干水分，称得鲜重，按每g5ml提取溶液，加入预冷的0.02mol/LKH2PO4溶液，加入材料鲜重10%PVPP（预先经过纯化，用蒸馏水吸胀）。在预冷的组织捣碎机中搅成匀浆。匀浆倒在烧杯中，于冰箱中浸提1小时，用4层纱布或尼龙布袋过滤，滤液于18000r/min冷冻离心15分钟，弃去沉淀，上清液即为酶的粗提取液。

（2）硫酸铵分级沉淀：用量筒量得酶液的体积，吸取5ml留作酶活性及蛋白质含量分析，保存在冰箱中，其余酶液加入固体硫酸铵，使达35%饱和度（参阅附表8），加硫酸铵时要缓慢，以避免造成局部浓度过高，在电磁搅拌器上边搅拌边加入。然后置冰箱中半小时，离心如上。分别收集上清液和沉淀，上清液中再加入硫酸铵使达65%饱和度，再离心，收集沉淀和上清液。按这样的方法分别收集0梍35%、35梍65%、65梍80%、80梍100%饱和度硫酸铵沉淀。每部分沉淀分别复溶于1/20原始提取液体积的0.02mol/LKH2PO4溶液中，装入透析袋中，用大量KH2PO4溶液（2000ml）在冰箱中进行透析过夜，其间更换KH2PO4溶液约4次，直至无（SO4）2-析出为止（用BaCl2溶液检查）。透析完毕后，分别量得适量体积，保存于冰箱中备用。

（3）蛋白质含量的测定：将原提取液及经硫酸铵分级沉淀得到的各分部溶液，用Folin试剂或考玛斯蓝G-250（参阅实验56）测定蛋白质含量，以牛血清蛋白作标准。

（4）酶活性的测定：以愈创木酚为底物测定酶活性（参阅实验49）。

（5）将结果填入下表中。