三种蛋白测定方法与标准曲线拟合

作为一位实验研究僧，老编一直致力于为大家分享实用技术知识。今天，老编给大家带来的是一些具有可操作性的三种蛋白测定方法与怎么样拟合标准曲线，轻松搞定蛋白浓度测定，谁看谁受用！

一、蛋白浓度测定的常见方法

1、考马斯亮蓝G250法测定蛋白浓度（bradford法）

1）实验原理

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G－250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm吸光度可测定蛋白质的含量。另外，反应体系中呈现的颜色变化主要是G-250分子间疏水相互作用形成的聚集体聚集程度不同引起的。单体形式表现为蓝色，单体和聚集体共存时表现为绿色，全为聚集体形式呈现为棕红色。影响因素主要为溶液体系中磷酸、乙醇、NaCl的含量。

蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/mL时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。

2）优缺点

此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X-100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。

标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。

3）试剂

①考马斯亮蓝G250溶液：100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤即可。

②标准蛋白溶液：纯的牛血清血蛋白(BSA)，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成1mg/ml蛋白溶液。

3）实验步骤

①绘制标准曲线

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色。

②未知样品蛋白质浓度测定

取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。

2、BCA法测量蛋白质浓度

关于蛋白质定量方法选择：BCA蛋白质定量试剂盒：

1）实验原理

BCA检测法是Lowry测定法的一种改进方法。蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与Cu2+络合生成络合物，同时将Cu2+还原成Cu+。二喹啉甲酸及其钠盐是一种溶于水的化合物，在碱性条件下，可以和Cu+结合生成深紫色的化合物，这种稳定的化合物在562nm处具有强吸收值，并且化合物颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。故可用比色的方法确定蛋白质的含量。

2）优缺点

与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。BCA法蛋白质浓度检测范围为10-2000 µg/ml。检测0.5~10 µg/ml微量蛋白时应采用浓缩试剂，并需要在60ºC反应。

但BCA法在样品含有脂类物质时将明显提高光吸收值。蛋白样品中EDTA或葡萄糖浓度大于10 mM不能使用BCA方法。

3）试剂

①BCA试剂的配制

试剂A（1L）：分别称取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。

试剂B（50ml）：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸馏水至50ml。

BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。

②标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。

4）实验步骤

①绘制标准曲线（略）。

②试剂加完后，混匀，于37℃保温30min，冷却至室温后，以0号管为对照，在562nm处比色。

③未知样品蛋白质浓度测定

3、紫外吸收法

1）实验原理

大多数蛋白质分子结构中含有芳香族氨基酸（酪氨酸和色氨酸）残基，使蛋白质在280nm的紫外光区产生最大光吸收。当入射光、吸光系数和溶液的光径长度L不变时，这一波长范围内的吸光值与蛋白质浓度成正比，利用这一特性可定量测定蛋白质的含量。

2）优缺点

此操作简便，测定迅速，低浓度盐类不干扰测定。但只适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；此外，此方法敏感度较低，要求蛋白的浓度较高（0.1-0.5mg/ml）。且玻璃器皿会吸收紫外线，需要石英等特殊材料器具。

3）试剂

①标准蛋白质溶液：精确配制2mg/ml的酪蛋白溶液。

②样品溶液

4）实验步骤

①绘制标准曲线（略）

②测定未知样品溶液

5）结果分析

根据样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液的蛋白质含量。

此外，紫外吸收法也可以不制作标准曲线，直接测280nm的OD值，然后通过OD值与校正系数直接求得未知蛋白的浓度。

上述三种方法在测定吸光值时，既可以使用紫外分光光度仪、酶标仪，甚至也可以使用Nanodrop微量计。它们所需要的样品量逐渐减少，所以制作标曲时不同仪器加入的试剂量也不尽相同，需要具体分析。

二、利用Excel软件拟合标准曲线

1、将标准蛋白测得的OD值及对应的浓度输入Excel表格中，并求出重复测量的平均值。

2、将0ug/ml对照管的OD值减去，进行背景校正。

3、将标准浓度和对应的校正值转变为列。（复制，选择性黏贴，转置）

4、选中校正值和浓度的数值，然后找到excel工具栏“插入”，在下拉窗口中选择“散点图”图标，并选择不带曲线的散点图。

5、在弹出的“标准曲线”图中，找到任意一个“散点”，右击该点，在弹出的菜单中选择“添加趋势线”。

6、接着会弹出一个参数选择窗口，在该窗口中选择“线性”趋势线，并勾选”显示公式“、”显示R平方值“。

7、不同的Excel版本，略微有些区别，选定参数后，点击“确定“。即可得到完整的标准曲线。一般R平方值≥0.99，即说明该拟合曲线可以使用。

8、将测得的未知蛋白OD值代入标准曲线公式”y = 1316.5x – 3.6272“中，即可求得未知蛋白的浓度。