【9.2.1】核酸的浓度、纯度的测定方法

核酸提取出来了之后，需要进行一个步骤——测浓度、纯度，实验室一般是使用的紫外分光光度法或荧光光度法来进行测定，下面对这核酸定量方法做一个整理。

一般指紫外-可见分光光度法；是在190～800nm波长范围内测定物质的吸光度，用于鉴别、杂质检查和定量测定的方法。

紫外分光光度法原理 ：单色光辐射穿过被测物质溶液时，在一定的浓度范围内被该物质吸收的量与该物质的浓度和液层的厚度（光路长度）成正比，因此通过光吸收的特点来对核酸进行定量。

核酸在波长260 nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的，所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质，不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。即在260nm的紫外波长下，1个吸光度值（A260nm=1）大约相当于50μg/ml的双链DNA、或相当于40μg/ml的单链DNA或RNA、或相当于33μg/ml的单链寡聚核苷酸，据此即可估算样品中核酸的浓度但紫外法不能区分DNA和RNA，只能用来鉴定核酸的纯度和含量。

蛋白质由于含有芳香氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值公为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。

RNA的260nm与280nm吸收的比值在2.0以上；DNA 260nm与280nm吸收的比值则在1.8左右。当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。

在TE缓冲液中，纯的DNA溶液260nm与280nm的比值应为1.8，纯的RNA溶液260nm与280nm的比值应为2.0，比值升高与降低均表示纯度不够。

260nm与280nm的比值是衡量蛋白质污染程度的一个良好指标，如果比值＜1.8，说明有蛋白质污染或酚残留（酚的紫外吸收峰在270nm处，可用于区分蛋白质污染或酚污染）。如果比值＞2.0，则可能是因为RNA的污染导致DNA制品260nm与280nm的比值升高。

需要注意的是，即使比值为1.8的DNA溶液也并不一定就是纯的DNA溶液，有可能同时存在蛋白质和RNA的污染，需要结合其他方法鉴定。

实验室最常用的NanoDrop就是基于以上原理；测试前选择正确的程序，测试样品的类型，首先测试空白液，然后再测试样品，注意输入样品稀释倍数。由于不同离子浓度，不同pH值都会对核酸的吸光值产生影响，导致检测误差。为了确保准确测量，要使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。如建议实验10 mM Tris-HCl pH 8.0的缓冲液进行溶解测量。当测量RNA时，用水而不是用TE 缓冲液稀释RNA样品会造成A260/A280比值下降。原因是低离子强度和低pH溶液会增加280 nm处的光吸收值。当260/230